Forschung

Drittmittelprojekt: DFG SFB 599 TP D13

Kliniken/Institute:
Klinik für Kleintiere

Projektdetails:
In dem hier vorgestellten Teilprojekt soll ein neuartiges Konzept zur Auslegung und Fertigung von patientenindividuellen Implantatprototypen erarbeitet werden. Das Konzept umfasst die Entwicklung, umformtechnische Prototypenherstellung und klinische Erprobung individualisierter Hüftprothesenpfannen für den Einsatz an caninen und humanen Patienten. CT-basierte Geometriedaten humaner und caniner Hüftgelenkpfannen dienen als Grundlage für die Auslegung individualisierter Prothesenpfannen. Ihre Herstellung erfolgt umformtechnisch aus biokompatiblen Titan-Blechwerkstoffen.

Die Versorgung schwerer Hüftgelenks­erkran­kungen mit künstlichen Hüfttotalendo­prothe­sen stellt in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin einen häufigen operati­ven Eingriff dar. Trotz langjähriger Erfahrung kommt es nach der Implantation immer wie­der zu Komplikationen, die zu einer Revision des Implantats führen. Insbesondere die Migration der Prothesenpfanne stellt ein gro­ßes Problem dar. Eine mögliche Ur­sache der Migration sind die veränderten mechanischen Bedin­gungen, die zu einem Knochen­abbau im Bereich der Pfannenkom­ponente führen können. Des Weiteren ist für eine ausreichend stabile Verankerung der Prothesenpfanne ein starker Knochenabtrag erforderlich, der den Kno­chenabbau begünstigt und eine Revisions­operation erschwert.

Eine Lösung dieser Problematik stellen pa­tientenindividuelle Hüftprothesenpfannen dar. Aufgrund des Einsatzes von kosten- und zeitintensiver Verfahren für die Herstellung patienten­individueller Prothesen, beschränkt sich der Einsatz einer individualisierten Pro­thesen­pfanne heutzutage jedoch nur auf die Behandlung von Pa­tienten mit starken Fehl­bildungen im Hüftgelenk oder mit Tumor­lokali­sation in diesem Bereich.Bis jetzt ist es nicht möglich eine individualisierte Pro­these mit vergleichbaren Preisen einer Groß­serie zu produzieren, was einer Verbrei­tung solcher Prothesen­komponenten entge­gen wirkt.

Ziel des Projekts besteht in der Entwicklung und Auslegung von patientenindividuellen, knochenschonenden und kostengünstigen Prothesenpfannen für Mensch und Hund. Hier­für wird ein Konzept zur Herstellung dieser individuellen Pfannen­komponenten mittels der Blechumformung erarbeitet.

Der erste Schritt der Pfannenkonstruktion stellt die Ermittlung der physiologischen Ge­gebenheiten des Acetabulums dar. Hierfür werden umfangreiche CT-Untersuchungen durchgeführt. Dabei werden Aufnahmen von gesunden sowie krankhaft veränderten Hüft­gelenken durchgeführt, die in einer Sammel­variantenbibliothek hinterlegt werden. Auf Basis dieser erfassten Daten soll durch den Einsatz von Reverse Engineering Methoden eine Universalbeckengeometrie modelliert werden. Hierfür werden die CT-Aufnahmen über ein Bestfit zur Superposition gebracht. Aus dieser räumlichen Überlagerung wird die universelle Geometrie abgeleitet und ein assoziativ-parametrisches Modell konzi­piert.
Im Anschluss ermöglicht dieser parametri­sche Aufbau die Anpassung der universellen Pfannengeometrie an die patienten¬individu¬elle Acetabulum¬geometrie durch die Anpassung der definierten Parameter.

Die umformtechnische Fertigung der indivi­dualisierten Prothesenpfannen soll mittels eines innovativen Blechumformverfahrens erfolgen. Aufbauend auf der generierten Uni­versalgeometrie werden normierte Titan­blechkomponenten im Untermaß erstellt, die mit Hilfe des konventionellen Tief­ziehens in Großserie gefertigt werden. Anschließend soll eine maßgerechte individuelle Weitung der erhaltenen Blechbauteile durch Nachformen mit einem modi­fizierten adaptiven Gummi­ziehverfahrens durchgeführt werden. Die Auslegung dieses neuartigen Prozesses soll mittels der Finite-Elemente-Methode erfolgen.

Die gefertigten Implantatprototypen werden unter Verwendung unterschiedlicher Verfah­ren getestet. Zunächst erfolgt die Erprobung der Prothese im Hunde Kadaverver­such. Mit Hilfe dieser Versuche werden geeignete chirurgische Zugänge zum Acetabulum für eine passgenaue Positionie­rung entwickelt. Des Weitren soll damit eine Aufwandabschät­zung des chirurgischen Ein­griffs im Vergleich zu konventionellen Pfannen­systemen erzielt werden.
Weiterhin soll die Prüfung der Komponenten im humanen Kunstknochen, später auch in Leichenbecken erfolgen. Dabei soll zum Einen das Bewegungsmaß in allen Richtungen er­fasst, zum Anderen eine Belastungsmessung in einer Materialtestmaschine durchgeführt werden.

Vision der Forschungsarbeiten ist die Steigerung der Lebensdauer von Implantaten durch eine Verbesserung der mechanischen Eigenschaften sowie durch die Entwicklung knochenschonender patientenindividueller Implantate. Mit Hilfe der kostengünstigen Fertigung unter Einsatz des vorgestellten Gummiziehverfah­rens soll zusätzlich die Wirschaftlichkeit individualisierter Prothesen­pfannen erhöht werden.

Kooperationspartner:

dr. A. Bouguesha, Institut für Umformtechnik und Umformmaschienen, Leibniz Universität Hannover

Prof. Dr. C. Stukenborg-Colsman, Diakoniekrankenhaus Annastift Abt.Orthopädie I, Hannover

Drittmittelprojekt: EU - Research Executive Agency, 100.000 EUR

Kliniken/Institute:
Institut für Lebensmitteltoxikologie

Projektdetails:
Eicosanoids and oxidative metabolites of other polyunsaturated fatty acids represent one of the most potent classes of endogenous cellular mediators. Although about 80% of pharmaceuticals influence the formation of these oxylipins, little is known in regard to alteration by food ingredients. The aim of this project is to investigate the effects of these compounds on endogenous oxylipin levels applying a targeted metabolomics approach. Numerous studies on the impact of nutrition on single eicosanoids have been carried out. Because biological effects arise from a multitude of oxylipins, this approach is incomplete. To solve this problem, we will simultaneously analyze the whole oxylipin pattern of all unsaturated fatty acids using liquid chromatography mass spectrometric methods (LC-MS). This metabolomics approach will provide a more complete description of the biological effects of food ingredients. ln a complementary approach, we will test the in vitro effect of food ingredients on the enzymes involved in the pathways of oxylipin formation, particularly their inhibition/activation, as well as their expression levels. For this purpose cell-free enzyme assays for the cyclooxgenase, lipoxygenase, cytochrome P450 and epoxide hydrolase pathways will be established. Pro- and anti-inflammatory effects of the compounds will be investigated in primary cell cultures cells followed by LC-MS read out. With these high-content screening tools, secondary plant metabolites contaminants and food additives will be investigated for modulation of oxylipin formation. The most active compounds will be tested in animal models for effects on regulatory lipids and on physiological end points including atherosclerosis, inflammation and pain. lt is proposed that these studies will lead to the discovery of food ingredients that alter regulatory lipids, provide understanding of the system involved, while providing new tools for the pharmacological and toxicological evaluation of xenobiotics.

Drittmittelprojekt: Landesbetrieb für Küstenschutz, Nationalpark und Meeresschutz Schleswig-Holstein, 126.318 EUR

Kliniken/Institute:
Institut für Terrestrische und Aquatische Wildtierforschung (Büsum)

Projektdetails:
Der Seehund ist die häufigste heimische Robbenart im schleswig-holsteinischen Wattenmeer. Die Seehundbestände wurden in den Jahren 1988/89 und 2002 durch eine Epidemie, die durch das Robbenstaupevirus hervorgerufen wurde, stark dezimiert. Viele sensible Parameter, die zur Beurteilung des Zustandes der Seehundpopulation im Nationalparkwattenmeer wichtig sind, können am toten Tier nicht mehr beurteilt werden. Hierzu gehören beispielsweise Blutuntersuchungen sowie immunologische und enzymatische Untersuchungen. Daher wurde initiiert neben den toten Seehunden auch die lebenden Tiere auf den Seehundbänken zu untersuchen.
Im Rahmen dieser Untersuchungen werden Seehunde im schleswig-holsteinischen Wattenmeer mit Netzen gefangen. Diese Aktion wird mit Hilfe von Mitarbeitern des Nationalparkamtes, des Nationalparkservice, der Seehundstation Friedrichskoog, des Amtes für Ländliche Räume, der Seehundjäger, der GKSS, des Leibniz-Instituts an der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel und weiteren Helfern durchgeführt. Die Seehunde werden vermessen und gewogen. Es werden Blut-, Haar- und Kotproben sowie Tupfer zur Bakteriologie entnommen. Aufgrund der Proben werden Blutbilder erstellt, blutchemische, zytologische, mikrobiologische und serologische Untersuchungen in Zusammenarbeit mit der Justus-Liebig-Universität Gießen und dem Landeslabor Schleswig-Holstein durchgeführt.
Im Rahmen des vom Bundesumweltministerium geförderten MINOSplus Projektes werden die Seehunde während der Fangaktion weiterhin mit Datenloggern ausgestattet (Leibniz-Institut an der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel), und es werden auditorisch evozierte Potentiale aufgezeichnet.

Resultate:

Ludes-Wehrmeister, E.; Dupke, C.; Harder, T. C.; Baumgärtner, W.; Haas, L.; Teilmann, J.; Dietz, R.; Jensen, L. F.; Siebert U.: Phocine distemper virus (PDV) seroprevalence as predictor for future outbreaks in harbour seals

In: Veterinary microbiology (2016), volume 183, pp 43-49

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26790934

Kooperationspartner:

Justus-Liebig-Universität Gießen

Leibniz-Institut an der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

Seehundstation Friedrichskoog

Kliniken/Institute:
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
Klinik für Rinder
Klinik für Kleintiere
Institut für Pathologie
Institut für Biometrie Epidemiologie und Informationsverarbeitung

Projektdetails:
TÄ Nicole Reusche

Über die Bedeutung apoptotischer und proliferativer Prozesse am pathologisch veränderten caninen Uterus ist bisher wenig bekannt. Im Schrifttum wird lediglich über deren Vorkommen und Ausprägung im gesunden Endometrium berichtet. Danach scheint es sich auch bei dieser Tierart um zyklische hormonabhängige Prozesse zu handeln mit einem Anstieg proliferativer Prozesse in der Follikelphase und einer Zunahme apoptotischer Zellen in der Lutealphase, der Endometriumreparation sowie zum Teil auch im Anöstrus.
Die Pathogenese der glandulär-zystischen Hyperplasie des Endometriums (GZEH) ist noch nicht (vollständig) geklärt. Beim Menschen gilt es als erwiesen, dass das anti-apoptotische Protein Bcl-2 an der Entstehung der zystischen Endometrium-hyperplasie beteiligt ist.
Neue Erkenntnisse werden erwartet hinsichtlich
- der Pathogenese sowie Klassifikation des sog. GZEH-Pyometra-Komplexes der Hündin.
- des Vorkommens apoptotischer und proliferativer Prozesse im zystisch veränderten Endometrium im Vergleich zum gesunden Endometrium.
- des Vorkommens der Apoptose-regulierenden Proteine Bcl-2 und Bax im gesunden und pathologisch veränderten Endometrium.

Resultate:

https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2018.03.018

Kliniken/Institute:
Fachgebiet Allgemeine Radiologie und Medizinische Physik
Anatomisches Institut

Projektdetails:
In diesem Projekt werden folgende Teilaufgaben bearbeitet:
- Erstellung virtueller, dreidimensionaler Modelle von equinen Schneidezähnen verschiedener Zahnaltersstufen zur Verwendung für die Finite-Elemente-Analyse,
- Berechnung der entstehenden Druck- und Zugspannungen in den einzelnen Zähnen sowie im Zahnhalteapparat,
- Computergestützte Simulation der Spannungsverteilungen im Schneidezahngebiss zur Aufklärung ätiopathologischer Prozesse der EOTRH (Equine Odontoclastic Tooth Resorption and Hypercementosis)

Resultate:

https://cdn.dgmp.de/media/document/1400/DGMP2015-Abstractband-final.pdf

Kooperationspartner:

Prof. Dr. Carsten Staszyk, Universität Gießen

Drittmittelprojekt: DFG (Ste 331/8-1), 111.537 EUR

Kliniken/Institute:
Institut für Zoologie

Projektdetails:
Wie viele andere Kleinsäuger können auch Dsungarische Zwerghamster (Phodopus sungorus) in den Wintermonaten durch Absenkung des Stoffwechsels und in Folge davon erniedrigte Körpertemperatur erheblich Energie einsparen. Diese Fähigkeit zum Torpor wird aber von einzelnen Individuen sehr variabel eingesetzt. Einige der Hamster werden über einen längeren Zeitraum täglich torpid, während andere Hamster im selben Zeitraum und unter identischen (Umwelt)-bedingungen sehr selten oder nie Torpor zeigen. In den letzten Jahren standen verstärkt die molekularen, biochemischen und neuroendokrinen Mechanismen der Steuerung von Torpor im Mittelpunkt des Interesses. Obwohl hier viele Details aufgeklärt werden konnten, müssen wir feststellen, dass auch nach Jahrzehnten der Forschung ganz grundlegende, ökophysiologische Fragen unbeantwortet bleiben: Was veranlasst einen Hamster dazu Torpor zu machen? Wann, unter welchen Umständen und aufgrund welcher Umweltsignale und welcher endogenen Signale "entscheidet" sich ein Hamster für Torpor? Und schließlich: Gibt es Indikatoren, die es ermöglichen vorherzusagen, ob und wann ein Hamster Torpor machen wird? Das Gesamtprojekt lässt sich dabei in vier Teilbereiche gliedern, in denen verschiedene Mechanismen oder Faktoren der Torporinduktion aus den Bereichen der Individualentwicklung, des Sozialverhaltens, der Ernährungsphysiologie sowie des Aktivitätsverhaltens der Dsungarischen Zwerghamster untersucht werden sollen.

Resultate:

Die Säugetiere der gemäßigten und arktischen Breiten sind mit beträchtlichen saisonalen Schwankungen von Temperatur und Futterverfügbarkeit konfrontiert. Besonders die niedrigen Umgebungstemperaturen des Winters erhöhen ihren Energiebedarf. Diese energetische Herausforderung führte zur Entwicklung einer großen Vielfalt an saisonalen Anpassungen, welche vornehmlich dazu beitragen, den Energieverbrauch zu reduzieren. Eine wichtige Form der Anpassung stellt die zeitlich begrenzte, kontrollierte Absenkung von Stoffwechsel und Körpertemperatur dar, welche in zwei grundsätzlichen Ausprägungen auftritt, als täglicher Torpor und als Winterschlaf. Täglicher Torpor ist durch eine eher moderate Reduktion von Stoffwechselrate und Körpertemperatur charakterisiert, die für einige Stunden anhält und für gewöhnlich auf die Ruhephase der Tiere beschränkt ist. Der Dsungarische Zwerghamster (Phodopus sungorus) wird seit langem als Modellorganismus verwendet, um saisonale Anpassungen und täglichen Torpor zu untersuchen. Interessanterweise zeigt diese Säugerart einerseits saisonalen spontanen, täglichen Torpor (SDT), welcher durch eine winterliche kurze Photoperiode induziert werden kann, andererseits aber auch fasten-induzierten Torpor (FIT) als Folge von Futterrestriktion. Während FIT als akute Antwort auf eine energetische Herausforderung gilt, tritt SDT auch bei uneingeschränkter Futterverfügbarkeit auf. In dieser Studie wurde unter Verwendung Ganztier-physiologischer Methodik eine Einschätzung von SDT in seiner Rolle als Energiesparmechanismus vorgenommen. Die Einschätzung basiert a) auf dem Vergleich zu FIT und b) der Untersuchung verschiedener Umweltfaktoren, welche die Energiebilanz der Hamster beeinflussen.

Die Ergebnisse dieser vergleichenden Studie in Kombination mit einer umfassen Literaturübersicht belegen, dass Hamster, die SDT zeigen, auch unter energetischer Belastung eine ausgeglichene Energiebilanz aufweisen. Im Gegensatz dazu tritt FIT unabhängig von etwaigen Energiesparmaßen durch saisonale Anpassungen auf und scheint ein letzter Ausweg zu sein, wenn die Körperfettreserven der Hamster nahezu erschöpft sind. Diese Befunde erlauben die Unterscheidung zwischen SDT als Teil eines saisonalen "Langzeit-Energieplans" und FIT als akuter "Notabschaltung".

Da nicht nur Futterquantität, sondern auch -qualität die Ausprägung von SDT beeinflusst, wurde der Effekt von ungesättigten Fettsäuren auf SDT untersucht. Die Aufnahme dieser Fettsäuren führt im Allgemeinen zu einer erhöhten Energiespareffizienz während des Winterschlafs, was hauptsächlich auf den positiven Einfluss dieser Fettsäuren auf die Funktionalität von Membranen und Geweben bei geringer Temperatur zurückzuführen ist. Im Gegensatz zu früheren Studien an Winterschläfern konnte beim Dsungarischen Zwerghamster weder ein hohes Verhältnis zwischen mehrfach-und einfach-ungesättigten Fettsäuren, noch ein hohes Verhältnis zwischen Ω-6- und Ω-3-Fettsäuren die Ausprägung und Energiespareffizienz von SDT positiv beeinflussen.

Obwohl eine konstant geringe Umgebungstemperatur die SDT-Ausprägung verstärkt, tritt dieser Effekt bei einem täglichen, semi-natürlichen Temperaturzyklus mit kalten Nächten und wärmeren Tagen bei adulten Hamstern nicht auf. Juvenile Hamster zeigten sogar eine verringerte SDT-Ausprägung als Antwort auf diese Umweltbedingungen. Da bei den Jungtieren der Anteil an unerwartet kurzen SDT Episoden sehr hoch war, nehmen wir an, dass der tägliche Anstieg in der Umgebungstemperatur die Torporepisoden unterbrochen hat. Adulte Hamster schienen gegenüber diesem Störfaktor sehr viel unempfindlicher zu sein.

Ein höchst interessantes Ergebnis erzielten wir durch die Behandlung der Hamster mit Somatostatin-Agonisten, was auf einen Einfluss der Wachstumsachse auf Torpor schließen lässt. Insbesondere Pasireotide erhöhte die Torporexpression bezüglich Tiefe und Dauer erheblich und eröffnet so einen neuen Ansatz, um die dem Phänomen Torpor und Winterschlaf zugrunde liegenden Mechanismen zu erforschen.

Wir konnten in allen Experimenten die bekannt hohe individuelle Variabilität der SDT-Nutzung innerhalb der verschiedenen Versuchsgruppen beobachten. Energetische Herausforderungen verstärken grundsätzlich die SDT-Ausprägung, jedoch finden sich dramatische Unterschiede im individuellen, relativen Beitrag von SDT zum gesamten Energiesparpotential saisonaler Anpassung. Alle Ergebnisse unterstreichen die Theorie einer endogenen SDT-Neigung. Obwohl die Gründe für die hohe Variabilität der SDT-Nutzung beim Dsungarischen Zwerghamster unbekannt bleiben, können wir dennoch resümieren, dass dieses Rätsel nur zu lösen sein wird, wenn SDT lediglich als eine - wenn auch sehr wichtige - Facette saisonaler Anpassung eingeordnet wird.

 

Diedrich V and Steinlechner S (2012) Spontaneous daily torpor versus fasting-induced torpor in the Djungarian hamster (Phodopus sungorus): two sides of a medal or distinct phenomena? In: Ruf T, Bieber C, Arnold W, Millesi E (eds). Living in a seasonal world: thermoregulatory and metabolic adaptations. Springer, Berlin, Heidelberg, pp 231-242

 

Diedrich V, Steinlechner S, Scherbarth F (2014b) Effects of unsaturated fatty acids on torpor frequency and diet selection in Djungarian hamsters (Phodopus sungorus). J Exp Biol 10/2014; DOI: 10.1242/jeb.113217

 

Diedrich V, Kumstel S, Steinlechner S (2014c) Spontaneous daily torpor and fasting-induced torpor in Djungarian hamsters are characterized by distinct patterns of metabolic rate. J Comp Physiol B, DOI: 10.1007/s00360-014-0882-4

 

Dumbell RA, Scherbarth F, Diedrich V, Schmid HA, Steinlechner S, Barrett P (2015) Somatostatin agonist pasireotide promotes a physiological state resembling short‐day acclimation in the photoperiodic male Siberian hamster (Phodopus sungorus). J Neuroendocrinol; DOI: 10.1111/jne.12289

 

Diedrich V (2015) Daily torpor in the Djungarian hamster (Phodopus sungorus): energetics and environmental challenges. Doctoral-Thesis, University of Veterinary Medicine Hannover, Germany

 

Scherbarth F, Diedrich V, Dumbell RA, Schmid HA, Steinlechner S, Barrett P (2015) Somatostatin receptor activation is involved in the control of daily torpor in a seasonal mammal, submitted (Am J Physiol - Regul Integr Comp)

Kooperationspartner:

Dr. Viktoria Diedrich, MHH

Dr. Annika Herwig, Universität Hamburg

Dr. Perry Barrett, University of Aberdeen

Drittmittelprojekt: EU (FP7), 636.210 EUR

Kliniken/Institute:
Institut für Parasitologie Zentrum für Infektionsmedizin

Projektdetails:
Infektionen mit dem Rinderlungenwurm Dictyocaulus viviparus, welcher nicht selten tödliche Lungenerkrankungen hervorruft, induzieren eine belastbare, für 6-12 Monate vor einer Erkrankung schützende Immunität. Diese natürliche Immunitätsbildung ist die Grundlage für das Forschungsvorhaben zur Entwicklung eines auf rekombinant exprimierten Proteinen basierenden Impfstoffs gegen den Rinderlungenwurm. Als Vakzinekandidaten sollen neben dem Muskelprotein Paramyosin, welches nur bei Wirbellosen anzutreffen ist, verschiedene sezernierte Antigene bezüglich ihres protektiven Potentials zunächst in vitro evaluiert und anschließend klinisch getestet werden.

Resultate:

http://cordis.europa.eu/result/rcn/181837_de.html

Kliniken/Institute:
Klinik für Pferde
Klinik für Kleintiere

Projektdetails:
Untersuchung an gesunden Pferden, der unspezifischen Immunantwort als Antwort auf eine Injektion von Transfektionsreagenz, Interleukin-DNA formuliert mit Transfektionsreagenz oder Nonsense-DNA formuliert mit Transfektionsreagenz. Gemessen werden sollen verschiedene Zytokine mittels LUMINEX-Technologie zu unterschiedlichen Zeitpunkten innerhalb 48 Stunden nach der Injektion. Zudem sollen Entzündungsmediatoren in Biopsien der Injektionsstellen untersucht werden.
Gruppengröße 6 Pferde pro Gruppe.

Kliniken/Institute:
Klinik für Pferde

Projektdetails:
Es soll eine Methode entwickelt werden um mit drei Hochfrequenzkameras die Auswirkungen verschiedener Kopf-Hals-Haltungen auf die Kinematik der Hintergliedmaßen des Pferdes analysieren zu können. Dabei wird schwerpunktmäßig die intraindividuelle Reproduzierbarkeit der Daten durch Mehrfachmessungen an einem Probanden, aber auch die individuellen Abweichungen zwischen verschiedenen Pferden bearbeitet werden. Die Ergebnisse sollen Aufschluss geben zu der aktuellen und historischen Frage nach der Interaktion zwischen Kopf-Hals-Haltung und Belastung, bzw. Korrelation der Gelenkwinkel vom Hüft- bis zum Fesselgelenk. Die Untersuchungen werden bei orthopädisch unauffälligen Pferden auf dem Laufband durchgeführt. Kopf, Wirbelsäule und Hinterbeine werden mit passiven Markern versehen, welche durch die Hochfrequenzkameras erfasst, mit einer neuen Computersoftware digitalisiert und dreidimensial bearbeitet werden.

Drittmittelprojekt: DFG, 181.795 EUR

Kliniken/Institute:
Institut für Parasitologie Zentrum für Infektionsmedizin

Projektdetails:
Cysteinproteasen werden von Parasiten auf vielfältige Weise benötigt: sie sind an der Häutung zum nächsten Stadium beteiligt und ermöglichen die Gewebswanderung und den Verdau aufgenommener Nahrung. Gleichzeitig dienen sie als Modulatoren der Immunantwort. In diesem Projekt sollen verschiedene Cysteinproteasen der Papainfamilie (Kathepsine) und Legumainfamilie (Asparaginylpeptidasen) hinsichtlich ihre molekularen Struktur und Funktion überprüft werden. Weiterhin soll mittels quantitativer real time PCR ihre Beschränkung auf die parasitische Lebensphase bestätigt und ihr Zusammenspiel mit einem Vertreter der Thyroglobulin-Familie untersucht werden.

Resultate:

Da Cysteinproteasen bei parasitischen Helminthen Funktionen bei der Gewebewanderung, dem Nahrungsaufschluss sowie der Immunevasion wahrnehmen und daher essentiell für die parasitische Lebensweise sein können, sollten im bearbeiteten Projekt verschiedene Cysteinproteasen der Cathepsin- und Legumain-Gruppe des bovinen Lungenwurms Dictyocaulus viviparus funktionell und bezüglich möglicher Interaktionen charakterisiert werden. In die Untersuchungen zu Interaktionen wurde ein Testican-ähnliches Thyroglobulin einbezogen, da für humanes Cathepsin L (CPL) eine Enzymhemmung durch dieses Thyroglobulin nachgewiesen wurde.

Für die mittels Transkriptionsanalyse untersuchten Cysteinproteasen B1, B2, B3, F, Z und Legumain 1 und 2 sowie Testican ergab sich, dass die Proteine primär in den parasitischen Stadien und nur in sehr geringem Umfang in den frei-lebenden Stadien transkribiert werden. Eine Ausnahme bildete CPL, welches in allen Stadien, vorwiegend aber den frühen frei-lebenden Larvalstadien transkribiert wird. In die rekombinanten Expression wurden CPL, die B-Cathepsine, die Legumaine und Testican einbezogen. Bezüglich einer funktionellen Charakterisierung der Cysteinproteasen stehen Ergebnisse für CPB-1 noch aus, da die trans-Aktivierung dieses Enzyms erst kürzlich gelang. Für die anderen exprimierten Cysteinproteasen wurde festgestellt, dass alle ausschließlich im saurem Milieu arbeiten und ein Optimum bei pH 4,5 bzw. pH 5,5 aufweisen. Bezüglich der Substratspezifitäten entsprachen CPL sowie die Legumaine den aus der Literatur erwarteten Ergebnissen. Die B-Cathepsine zeigten hingegen eine höhere Affinität zum CPL- anstelle des CPB-spezifischen Substrats. Dies ist jedoch schon bei B-Cathepsinen anderer parasitischer Helminthen beobachtet worden und ist durch den molekularen Aufbau der jeweiligen aktiven Zentren erklärbar. Auch die Testung des Einflusses verschiedener Protease-Inhibitoren zeigte insgesamt die aus der Literatur erwarteten Ergebnisse. Eine Ausnahme bildete hierbei Leg-2, dessen hohe Sensitivität gegenüber verschiedenen Cysteinproteaseinhibitoren nicht erwartet worden war. Dies weist darauf hinweist, dass es sich bei Leg-2 um einen eher untypischen Vertreter der Legumain-Gruppe handelt. Bei der Evaluierung potentieller natürlicher Substrate zeigten alle Proteasen die Fähigkeit, verschiedene bovine Proteine zu spalten. Bovines Kollagen I und II wurden dabei von allen Cysteinproteasen gespalten. Mit Ausnahme von Leg-2 spalteten die verschiedenen Proteasen zudem Bestandteile des Bronchialschleims, der dem Parasiten als Nahrungsgrundlage dient.

Mittels in Kaninchen produzierter polyklonaler Antikörper konnten die Transkriptionsmusteranalysen auch auf Expressionsebene bestätigt werden. Zusätzlich zur stadienspezifischen Expression erfolgte auch eine Lokalisation der einzelnen Proteasen im Lungenwurmgewebe. Dabei zeigte sich, dass CPB-2 und -3 wie auch die Legumaine im Darm des Parasiten lokalisiert sind. Es kann daher von einer Funktion beim Verdau aufgenommener Nahrung ausgegangen werden. CPL, welches in nahezu allen Organen der Adulten sowie im Inneren von frei-lebenden Larven exprimiert wird, ist in Letzteren vermutlich am Umsatz von Speicherproteinen oder auch Häutungsvorgängen beteiligt, während bei der Umstellung auf die parasitische Lebendweise die Funktion einer unspezifischen lysosomalen Protease eingenommen werden könnte.

Interaktionsversuche der Cathepsine mit dem Thyroglobulin Testican ergaben, dass Testican ein hochaffiner, reversibler, kompetitiver Inhibitor von CPB-3 ist, wobei die inhibitorische Wirkung aus einer Bindung an das aktive Zentrum von CPB-3 resultiert. Damit konnte bei Helminthen erstmalig eine Regulation von Cysteinproteasen durch Thyroglobuline nachgewiesen werden. Anders als beim Menschen erfolgt beim Rinderlungenwurm jedoch eine Regulation eines B-Cathepsin anstelle eines L-Cathepsins.