3R SMART

Projektbeschreibung:
Die Richtlinie 2010/63/EU verpflichtet zu einer konsequenteren Umsetzung des 3R-Prinzips bei der Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken, mit der Folge verstärkter Forschungs-aktivitäten auf diesem Gebiet. Diese 3R-Forschungsaktivitäten wollen die Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und die Philipps-Universität Marburg im Verbund durch ein Pilotprojekt zum Aufbau einer Open-Access-Schulungsplattform für 3R-Methoden unterstützen sowie verstärkt transparent und sichtbar machen. Die 3R-Schulungsplattform für Methodische Ansätze zur Reduktion von Tierversuchen  (3R-SMART) ist kompetenzorientiert an die Bedürfnisse von Wissenschaftlern, Studierenden, sowie technischem Personal an Hochschulen, öffentlichen Forschungseinrichtungen und in der Industrie angepasst. Um in dieser Zielgruppe eine breite Akzeptanz der 3R-SMART sicherzustellen, sind in deren inhaltliche Gestaltung das EU Center for Alternatives to Animal Testing, das Deutsche Zentrum zum Schutz von Versuchstieren (Bf3R) am BfR, die Gesellschaft für Versuchstierkunde (GV-SOLAS), die Universitäten von Marburg und Konstanz, die FU Berlin mit der Berlin-Brandenburger Forschungsplattform BB3R, das Paul-Ehrlich-Institut, und die BASF eingebunden.

Um von Beginn an eine hohe Sichtbarkeit zu gewährleisten, soll 3R-SMART in die etablierte Schulungs-Plattform für Versuchstierkunde (LAS interactive), die von der Philipps-Universität Marburg betrieben wird, integriert werden. Zudem erlaubt dieses Konzept, die bewährten LAS interactive-Strukturen und -Inhalte für die 3R-SMART zu nutzen. Die LAS interactive ist auf anwendungsorientierte Online-Beiträge zum Refinement von Tierversuchen fokussiert. Diese Beiträge werden initial die Basis für das Refinement-Modul der 3R-SMART bilden, so dass bei der Entwicklung der 3R-SMART der Fokus auf Schulungen zu methodischen „Replacement“- und „Reduction“-Ansätzen von Tierversuchen gelegt werden kann.

Entsprechend den EU-Standards ist die Vermittlung von Kenntnissen zum 3R-Prinzip in Kursen zum Erwerb der versuchstierkundlichen Sachkunde essentiell. Die 3R-SMART wird daher auch genutzt, um ein Curriculum auszuarbeiten, das es erlaubt, diese 3R-Kompetenzen durch eine Online-Prüfung nachzuweisen. Dieses Curriculum wird in enger Zusammenarbeit mit der GV-SOLAS erarbeitet, die versuchstierkundliche Kurse gemäß den Vorgaben der europäischen Standards zertifiziert.

Nach der Projektlaufzeit von drei Jahren ist beabsichtigt, den Verbreitungsgrad der 3R-SMART auf das europäische Niveau auszuweiten. Dazu soll die 3R-SMART in die EU-Plattform “Education and Training in Laboratory Animal Science” (ETPLAS) aufgenommen werden. Um diese Nachhaltigkeitsstrategie zu unterstützen, wird die 3R-SMART im Projektzeitraum zweimal umfänglich evaluiert. Auf diese Weise kann das beantragte Projekt einen signifikanten und nachhaltigen Beitrag für eine breitere Verwendung von 3R-Methoden und einen entsprechend reduzierten Einsatz von Versuchstieren leisten.

Förderung:
3R-SMART, Bundesministerium für Bildung und Forschung

Projektverantwortlicher:
Prof. Dr. Bernhard Hiebl (bernhard.hiebl(at)tiho-hannover.de; 0511-856-8958)
Institut für Tierhygiene, Tierschutz und Nutztierethologie

Antibiotika-Resistenzentwicklung

In vitro-Untersuchungen zur Resistenzentwicklung

Methoden:

  • Bestimmung der Minimalen Hemmkonzentration

Projektbeschreibung:
Für die Nutzung in verschiedenen Forschungsprojekten wird ein In-vitro-Modellsystem entwickelt und etabliert, welches es erlaubt, anhand der Verschiebung der minimalen Hemmkonzentration den Einfluss von antibakteriellen Wirkstoffen auf die Resistenzentstehung zu charakterisieren.

Projektverantwortliche:
Dr. Jessica Meißner (jessica.meissner(at)tiho-hannover.de; 0511-953 8723)
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

Bakterielle Infektionen in Mensch und Tier

In vitro und In vivo-Charakterisierung der angeborenen Immunantwort gegen bakterielle Infektionen im Mensch und Tier

Methoden:

  • Primäre Neutrophile (Human, Schwein, Rind, Pferd, Maus)
  • Primäre Lungenepithelzellen (Human, Maus, Schwein)
  • Choroid-Plexus-Epithelzellen (Human, Schwein)
  • Darmepithel (Human)
  • Primäre Mastzellen (Human, Maus)

Eine erhöhte Komplexität, die der in vivo Situation näher kommen soll, wird durch physiologisch relevante Sauerstoffbedingungen und durch 3D-Co-Kultivierung von Epithelzellen und Neutrophilen ermöglicht. Für definierte hypoxische Bedingungen steht eine hypoxia glove box zur Verfügung.

Projektbeschreibung:
Das weltweit gehäufte Auftreten von resistenten Bakterien limitiert die Effizienz von Antibiotika-basierten Behandlungskonzepten. Neue vielversprechende Therapieansätze werden benötigt wie zum Beispiel die Stärkung der wirtseigenen Abwehr durch Stimulation des Immunsystems als Unterstützung der konventionellen Antibiotika-basierten Therapie. Jedoch sind die komplexen Wirt-Pathogen-Interaktionen nach wie vor unzureichend aufgeklärt. Detailliertes Wissen ist erforderlich, um therapeutischen Strategien, die auf der angeborenen Immunabwehr basieren, anzuwenden. Aufgrund mangelnder Komplexität, eines falschen Zelldifferenzierungsstatus und fehlender physiologischer Bedingungen simulieren In vitro-Systeme jedoch nicht immer präzise die in vivo-Situation während einer Infektion oder Entzündung. Ergebnisse aus konventionellen In vitro-Experimenten, die die Wirt-Pathogen-Interaktion oder therapeutische Ansätze untersuchen, widersprechen häufig Daten aus in vivo-Studien und können daher schwer übertragen werden. Tierversuchsfreie Testsysteme sowohl für Infektions- und Interaktionsstudien als auch für Drug-screenings sind nur dann eine echte Alternative, wenn sich die erhaltenen Ergebnisse verlässlich auf eine In vivo-Situation übertragen lassen.

Unser Ziel ist es daher, verbesserte In vitro-Modellsysteme zu etablieren, die die angeborene Immunantwort gegen bakterielle Erreger verlässlich simulieren. Eine erhöhte Komplexität des Modellsystems ermöglicht die Annäherung des In vitro-Systems an die In vivo-Situation und hilft dadurch die Versuchstieranzahl zu reduzieren.

Projektverantwortliche:
Prof. Dr. Maren von Köckritz-Blickwede, (Maren.von.Koeckritz-Blickwede(at)tiho-hannover.de 0511-856-8787)
Institut für Biochemie & Research Center for Emerging Infections and Zoonoses (RIZ)

Biokompatibilität von Nanopartikeln

In vitro-Testbatterie zur Prüfung der Biokompatibilität von Nanopartikeln

Methoden:

  • Zellkultur von murinen dendritischen Zellen, Makrophagen und Osteoblasten zur Untersuchung der Biokompatibilität von Implantaten, Nanopartiklen und anderen Testsubstanzen
  • Zellmigrationsassays
  • Vitalitätsassays
  • Proliferationsassays
  • Messung der Zytokinfreisetzung (Zellkultur und Gewebeschnitte)

Projektbeschreibung:
In einem DFG-Projekt werden magnetische Nanopartikel entwickelt, die als Carrier für Wirkstoffe genutzt werden sollen. Zur Prüfung der Wirkstofffreisetzung und der Biokompatibilität der Nanopartikel werden aussagekräftige In vitro-Modellsysteme erarbeitet. Hierzu ist in der eigenen Arbeitsgruppe neben Arbeiten an Zellkulturen das isoliert perfundierte Rindereuter (Ex vivo-Modell) etabliert. Ziel des Projekts ist letztlich der Aufbau einer In-vitro-Testbatterie zur Prüfung der Biokompatibilität, die erlaubt, für den In vivo-Einsatz geeignete Nanopartikel auszuwählen.

Projektverantwortliche:
Dr. Jessica Meißner (jessica.meissner(at)tiho-hannover.de; 0511-953-8723)
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

Bovine Euterpräzisionsschnitte

Bovine Präzisionseuterschnitte als In vitro-Modell zur Charakterisierung des frühen Infektionsgeschehens einer Mastitis

Methoden:

  • Präzisionseuterschnitte (PCBUS)

Projektbeschreibung:
Präzisionsschnitte verschiedener Organe sind in der pharmakologisch-toxikologischen Forschung zur Untersuchung von Fremdstoffeinwirkung, Arzneimitteleffekten und toxikologischer Fragestellen etabliert.

In der Arbeitsgruppe konnten erfolgreich bovine Präzisionseuterschnitte etabliert werden. Diese erlauben es, das frühe Infektionsgeschehen einer Mastitis in vitro zu untersuchen, indem eine Co-Kultur mit Mastitis-relevanten Keimen (u.a. Staphylococcus aureus) angesetzt wird. Der komplexe Gewebeverband der Präszisionsschnitte ermöglicht dabei eine umfassende Charakterisierung von Gewebereaktionen auf unterschiedlichste Krankheitserreger. In einem nächsten Schritt soll die arzneiliche Behandlungsmöglichkeit im frühen Infektionsstadium näher charakterisiert werden.

Projektverantwortliche:
Dr. Jessica Meißner (jessica.meissner@tiho-hannover.de; 0511-953 8723)
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

Equine Lungenpräzisionsschnitte

Equine Präzisionsschnitte als In vitro-Modell obstruktiver Atemwegserkrankungen zur Identifizierung möglicher therapeutischer Targets und zur Charakterisierung von Arzneistoffen

Methoden:

  • Präzisionslungenschnitte (PCLS)

Projektbeschreibung:
Präzisionsschnitte verschiedener Organe sind in der pharmakologisch-toxikologischen Forschung zur Untersuchung von Fremdstoffeinwirkung, Arzneimitteleffekten und toxikologischer Fragestellen etabliert.

In Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Ohnesorge (Klinik für Pferde) wurden erfolgreich Präzisionslungenschnitte vom Pferd etabliert, die es erlauben, Pathomechanismen der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung beim Pferd näher zu charakterisieren und mögliche Behandlungsansätze in vitro zu untersuchen. Der intakte Gewebeverband ermöglicht dabei die Untersuchung von komplexen Krankheitsgeschehnissen.

Projektverantwortliche:
Dr. Jessica Meißner (jessica.meissner@tiho-hannover.de; 0511-953-8723)
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

FERTHIK II

Vermittlung von tiermedizinischen, klinischen Fertigkeiten und Implementierung von Ethik in der Tiermedizin

Methoden:

  • Praktische Übungen an Modellen
  • Entwicklung von Modellen
  • Betreuter Kleingruppenunterricht im Peer-Group Teaching
  • Lernen durch Videomaterial
  • Reflexion in Hinblick auf Tierschutz und Ethik


Projektbeschreibung:
Das Projekt „Vermittlung von tiermedizinischen, klinischen Fertigkeiten und Implementierung von Ethik in der Tiermedizin (FERTHIK II)“ ist ein Nachfolgeprojekt von „FERTHIK - Vermittlung von tiermedizinischen, klinischen Fertigkeiten unter besonderer Berücksichtigung ethischer Aspekte“. Durch die Projekte wurde das Zentrum für klinische Fertigkeiten (Clinical Skills Lab, CSL) an der TiHo aufgebaut und das Angebot an Lernstationen stetig erweitert. Im CSL wird das Lernen und Üben von klinischen Fertigkeiten an Modellen für Studierende der Tiermedizin aller Semester ermöglicht mit dem Effekt, Übungen am lebenden Tier nicht weiter ausbauen zu müssen. Durch FERTHIK soll die Lehre im Bereich der praktischen Fertigkeiten der Studierenden bei der Behandlung von Haus- und Nutztieren unter Berücksichtigung des Tierschutzes und ethischer Fragestellungen verbessert (Skills und Attitudes) und somit der Praxisbezug des Studiums erhöht werden. Im Rahmen des Projektes werden darüber hinaus Simulatoren und Modelle gemeinsam mit den Kliniken und Instituten der TiHo im Skills Lab entwickelt. Als weiterer Bestandteil der Lernstationen und Modelle im CSL werden neben dem Üben der praktischen Tätigkeiten Fragestellungen des Tierschutzes und der Tierethik erörtert, die in Verbindung mit den praktischen Tätigkeiten stehen und mit denen sich die Tierärztin/der Tierarzt auseinanderzusetzen hat. Durch das Trainieren praktischer Fertigkeiten an Modellen in einer „sicheren“ Umgebung entwickelt sich bei den Studierenden eine Routine in der Durchführung einer tierärztlichen Fertigkeit vor der ersten Intervention am Tier. Die Studierenden haben ferner die Möglichkeit, diese sog. „Day-one-Kompetenzen“ mehrfach an den Simulatoren durchzuführen und erarbeiten durch das wiederholte Üben die eigene Sicherheit, gut vorbereitet und kompetent als Berufsanfänger/-innen in den Alltag eines Tierarztes/einer Tierärztin zu starten, was dem Tierwohl in der Praxis ebenfalls zugutekommt. Die klinischen Fertigkeiten, die an den Lernstationen geübt werden können, werden aufgezeichnet und das Videomaterial zur Vor- und Nachbereitung auf dem YouTube-Kanal TiHoVideos zur Verfügung gestellt.

Förderung:
FERTHIK II, Bundesministerium für Bildung und Forschung (Bund-Länder-Programm Qualitätspakt Lehre)

Projektverantwortliche:
Prof. Dr. Andrea Tipold (Andrea.Tipold(at)tiho-hannover.de; 0511-953-6411)
Klinik für Kleintiere

Dr. Elisabeth Schaper (Elisabeth.Schaper(at)tiho-hannover.de; 0511-953-8036)
Zentrum für E-Learning, Didaktik und Ausbildungsforschung (ZELDA)

Dr. Sandra Wissing (Sandra.Wissung(at)tiho-hannover.de; 0511-856-8360)
Zentrum für E-Learning, Didaktik und Ausbildungsforschung (ZELDA)

Prof. Dr. Peter Kunzmann (Peter.Kunzmann(at)tiho-hannover.de; 0511-856-8959)
Institut für Tierhygiene, Tierschutz und Nutztierethologie

Glykan-Array-Plattform

Glykan-Array-Plattform zum In vitro-Präscreening auf Kohlenhydrat-basierte Adjuvantien und Immunmodulatoren

Methoden:
Glykan- und Lektin-Arrays; In vitro-Ko-Kulturen aus Antigen-präsentierenden Zellen und T-Zell-Rezeptor-transgenen T-Zellen

Projektbeschreibung:
Die Testung von Adjuvantien und Immunmodulatoren in vivo erfordert eine große Zahl an Versuchstieren, so dass geeignete In vitro-Präscreenings dringend notwendig sind, um die Tierzahl für in vivo-Studien zu minimieren. Im Rahmen dieses Projekts wird eine neue Plattform zum Screening auf Kohlenhydrat-basierte Adjuvantien und Immunmodulatoren entwickelt. Immobilisierte synthetische bzw. aus Pathogenen isolierte Glykane werden auf Microarray-Chips immobilisiert und auf ihre Bindung an C-Typ Lektinrezeptoren (CLRs) der angeborenen Immunität getestet. Myeloide CLRs sind Kohlenhydrat-bindende Proteine (sogenannte Lektine), die vor allem von Antigen-präsentierenden Zellen exprimiert werden, Zuckerstrukturen auf Pathogenen erkennen und dadurch adaptive Immunantworten einleiten können. Das Targeting von CLRs ist eine vielversprechende Strategie, um Immunantworten gegen Impfstoff-Antigene zu verstärken oder auch Immunreaktionen gezielt zu modulieren (Lepenies et al., Adv. Drug. Deliv. Rev. 2013, 65, 1271-81). In Vorarbeiten eine Bibliothek von CLR-Fc Fusionsproteinen generiert, bei der der extrazelluläre Teil jedes CLR mit dem Fc-Fragment humaner IgG1-Moleküle fusioniert wurde (Maglinao et al., J. Control. Release 2014,175, 36-42). Die generierte CLR-Fc-Bibliothek umfasst mittlerweile alle immunologisch relevanten murinen CLRs und wird in diesem Projekt auf humane und ovine CLRs erweitert. Kohlenhydrate, die mittels Glykan-Array als CLR-Liganden identifiziert wurden, werden anschließend an Modellantigene gekoppelt und in Ko-Kulturen aus dendritischen Zellen und T-Zell-Rezeptor-transgenen T-Zellen auf ihre immunstimulierenden bzw. –modulierenden Eigenschaften in vitro getestet (Brzezicka et al., ACS Chem. Biol. 2016, 11, 2347-56). Dieses In vitro-Präscreening erlaubt eine Vorauswahl geeigneter Glykane als Kandidaten für neue Adjuvantien und Immunmodulatoren und reduziert somit die Zahl an Versuchstieren für Immunisierungsstudien.

Projektverantwortliche:
Prof. Dr. Bernd Lepenies (bernd.lepenies(at)tiho-hannover.de 0511-953-6135)
Marie-Kristin Raulf (Marie-Kristin.Raulf(at)tiho-hannover.de 0511-953-6124)
Institut für Immunologie & Research Center for Emerging Infections and Zoonoses

Innerviertes Hautmodell

Entwicklung eines humanen innervierten Hautmodells zur Identifizierung Haut-sensibilisierender Substanzen

Methoden:

  • Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zu sensorischen Neuronen
  • Differenzierung von hiPSCs zu Schwann Zellen
  • Co-Kultur der beteiligten Zellen (sensorische Neuronen, Schwann Zellen, Fibroblasten, Keratinozyten) in einer hydratisierten Matrix
  • Quantifizierung des Neuritenauswuchses im Hautmodell

Projektbeschreibung:
Produkte des täglichen Lebens wie Kosmetika, Kleidung oder Arzneimittel kommen mit der Haut in Kontakt. Eine Sensitivierung der Haut, ausgelöst durch Kontaktallergene, äußert sich als eine unangenehme, mit Juckreiz einhergehende, allergische Kontaktdermatitis. In Europa ist etwa ein Viertel der Bevölkerung betroffen. Hersteller müssen gewährleisten, dass Substanzen, die mit der Haut in Kontakt kommen, keine Kontaktallergie auslösen. Die Identifizierung von Haut-sensibilisierenden Substanzen beruht auf einem Adverse Outcome Pathway (AOP) mit bestimmten Schlüsselereignissen, die über die In vitro-Aktivierung von Keratinozyten, dendritischen Zellen und die In vivo-Aktivierung von T-Zellen untersucht werden können. Der so genannte Adverse Outcome, also die allergische Kontaktdermatitis kann bisher nur über wenig repräsentative Tierversuche untersucht werden.

In diesem Projekt wird ein 3D Hautmodell entwickelt, das sensorische Neuronen und Schwann-Zellen enthält, die aus humanen iPSCs abgeleitet wurden, um das vermehrte Neuritenwachstum in vitro zu quantifizieren, das dem Pruritus, einem Schlüsselsymptom der allergischen Kontaktdermatitis, entspricht. Dieser Assay könnte den bisher existierenden AOP ergänzen und es ermöglichen, die Lücke zwischen In vitro-Experimenten und in vivo induzierter allergischer Kontaktdermatitis deutlich zu verringern.

Projektverantwortliche:
Prof. Bettina Seeger, Ph.D. (bettina.seeger(at)tiho-hannover.de; 0511-856-7602) und
Maren Schenke, Ph.D. (maren.schenke(at)tiho-hannover.de; 0511-856-7603)
Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit

Insektenembryonen zur Prüfung auf Entwicklungsneurotoxizität

Ein intakter Insektenembryo als Testsystem zur sicherheitstoxikologischen Prüfung auf Entwicklungsneurotoxizität

Methoden:

  • Serumfreie Embryokultur
  • Immunfluoreszenz
  • Neuroanatomie

Projektbeschreibung:
Entwicklungsneurotoxizität (Developmental Neurotoxicity, DNT) beschreibt die funktionellen und morphologischen Effekte auf das sich entwickelnde Nervensystem der Nachkommen, die durch die Schadstoff-Exposition während der Schwangerschaft und der frühen postnatalen Entwicklung auftreten können. Die derzeit für die Untersuchung von Stoffen auf DNT zugelassenen in vivo Tests beinhalten einen sehr hohen Tierverbrauch und sind aufwändig und für die Versuchstiere sehr belastend. Im Vorhaben wurde ein einfaches Evertebraten-Testsystem entwickelt werden, das die Komplexität der Wegfindungsprozesse bei der embryonalen Gehirnentwicklung widerspiegeln kann. Dieses Versuchssystem erfasst als funktionellen Endpunkt nach der Chemikalienexposition die Störungen axonaler Wegfindung von identifizierten Pionieraxonen in der Beinknospe von Heuschreckenembryonen auf ihrem Weg ins zentrale Nervensystem. Ein essenzieller Aspekt der Gehirnentwicklung ist die präzise Verknüpfung zwischen den Nervenzellen. Das Testsystem erfasst nach der Chemikalienexposition die Störungen der neuronalen Verschaltung von identifizierten Pionieraxonen zum zentralen Nervensystem. Die auswachsenden Zellfortsätze dieser Pionierneuronen bahnen sich entlang von Semaphorin Wegweisermolekülen ihren Weg zum zentralen Nervensystem. Die zellulären Mechanismen dieser Navigation von neuronalen Fortsätzen sind zwischen Wirbellosen und der Hirnrinde von Säugetieren in der Evolution nicht verändert worden. Daher erlaubt die Sensitivität auf gefährliche Chemikalien im Insektenembryo-Test auch Aussagen über die Entwicklungsneurotoxizität beim Menschen. Ein weiteres Ziel dieses Projekts war die 3D Erfassung der Morphologie der Pioniere mittels der Scanning Laser Optical Tomography (SLOT). Dazu wurden fixierte Embryonalstadien mit unterschiedlichen histologischen Aufklarungsmethoden behandelt. Unsere Projektpartner im Laser Zentrum Hannover (LZH) erstellten die optisch-tomographischen Rohdaten und errechneten die entsprechenden 3D Projektionen. In Zusammenarbeit mit dem LZH wurde gezeigt, dass die etablierten entwicklungsneurotoxischen Verbindungen Methylquecksilber und Natriumarsenit für die axonale Navigation vom SLOT Verfahren ebenfalls als DNT-positiv identifiziert wurden. Das SLOT Verfahren könnte in Kombination mit maschinellen Bild-Segmentierungsverfahren eine genauere Klassifizierung von Wegfindungsfehlern erlauben.

https://www.youtube.com/watch?v=SrdjplVsWto

Projektverantwortliche:
Prof. Dr. Gerd Bicker (gerd.bicker.iR(at)tiho-hannover.de; 0511-856-7765)
PD Dr. Michael Stern (michael.stern(at)tiho-hannover.de; 0511-856-7767)
Institut für Physiologie und Zellbiologie

Intestinale Organoide und intestinale Epithelzellen zur Erforschung von Darmerkrankungen

Entwicklung eines In vitro-Modells zur Erforschung der Pathogenese-Mechanismen von Zoonoseerreger-induzierten Darmerkrankungen

Methoden:

  • Cokultur von humanen Enterozyten und Becherzellen
  • Kultivierung von intestinalen Organoiden vom Schwein
  • Analyse nach Behandlung mit bakteriellen Toxinen mit Ussing-Kammer, RT-qPCR, Western Blot, Immunfluoreszenz

Projektbeschreibung:
Der Darm spielt für viele vom Tier auf den Menschen übertragbare Erkrankungen (sog. Zoonosen) eine entscheidende Rolle. Sowohl in der Etablierung einer Infektion, als auch für die Ausscheidung von Pathogenen und der damit potentiell verbundenen Ausbreitung einer Infektion. Während verschiedene auf Zellkulturen basierende In-vitro-Systeme für die Erforschung von Krankheitsmechanismen bei Mäusen, Ratten und dem Menschen zur Verfügung stehen, ist für die Untersuchung solcher Vorgänge bei Nutztieren (z. B. bei Schweinen, Rindern oder Geflügel) immer noch die Verwendung von direkt aus dem Tier entnommenen Primärzell- oder Organkulturen oder sogar der Einsatz von Tieren notwendig. Aus diesem Grund sind neue Ansätze zur Entwicklung von In-vitro-Modellen zur Erforschung zugrundeliegender molekularer Mechanismen von Infektionen bei Nutztieren von großem Interesse, insbesondere vor dem Hintergrund, dass Nutztiere häufig Träger bzw. Überträger zoonotischer Krankheitserreger sind. Der Zweck des vorliegenden Projektes besteht daher darin, ein Modell des Darms zu entwickeln, indem erstmalig die sog. "Colon-Simulations-Technik" (Cositec) mit der "Ussing-Kammer-Technologie" verknüpft wird. Dabei wird intakte Darmschleimhaut von Nutztieren in Ussing-Kammern eingespannt und zeitgleich mit dem Inhalt des Cositec-Systems inkubiert, so dass eine Konfrontation des Darmepithels mit dem physiologischen Darminhalt erfolgen kann. Die Kombination dieser beiden gut etablierten Methoden ermöglicht es so, ein In-vitro-Modell zu entwerfen, dessen Bedingungen weitestgehend mit den In-vivo-Verhältnissen übereinstimmen. In einem ersten Schritt werden die Vitalität und Funktionalität des Darmepithels in diesem System anhand von morphologischen, biochemischen und funktionellen Analysen überprüft (z. B. mittels Histologie, PCR oder Nährstoffaufnahme). Von großer Bedeutung ist dabei, dass das für alle Analysen verwendete Darmgewebe nicht von Versuchstieren stammt, sondern stets auf konventionellen Schlachthöfen gewonnen wird. So kann auf den Einsatz von Versuchstieren vollständig verzichtet werden. Im darauffolgendem Schritt soll eine Inkubation des Darmepithels mit Zoonoeserregern (z. B. enterotoxische und enteropathogene E. coli) erfolgen, um Infektionsmechanismen dieser Pathogene und deren Auswirkungen auf den Darm genauer untersuchen zu können. Sollte dieses neue System funktionieren, würde es, abgesehen von der Erforschung von Infektionserkrankungen, eine Vielzahl von weiteren Nutzungsmöglichkeiten bieten. Dazu gehören beispielsweise physiologische, toxikologische oder auch pharmakologische Fragestellungen. Weiterhin könnten in diesem Modell auch Zellkulturen des Darmes eingesetzt werden, was die Verwendung von tierischem Material größtenteils überflüssig machen würde. Insgesamt würde eine erfolgreiche Etablierung dieses Systems eine deutliche Abnahme der Versuchstierzahlen zur Folge haben.

Förderung:
R2N, Niedersächsisches Ministerium für Wissenschaft und Kultur, 2017-2021

Projektverantwortliche:
Prof. Dr. Gerhard Breves (gerhard.breves(at)tiho-hannover.de, 0511-856-7271), Institut für Physiologie und Zellbiologie
Prof. Bettina Seeger, Ph.D. (bettina.seeger(at)tiho-hannover.de; 0511-856-7602), Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit

Kanine und murine Schnittkulturen des zentralen Nervensystems

Organotypische kanine und murine Schnittkulturen als in vitro-Modell für die Untersuchung glialer Reaktionen und Interaktionen bei neurotraumatischen, -infektiösen, und –degenerativen Erkrankungen des zentralen Nervensystems

Methoden:
Organotypische Schnittkulturen des zentralen Nervensystems sind als intermediäres Modell zwischen Tierversuchen in vivo und Dissoziationskulturen in vitro anzusehen und stellen ein geeignetes Modell dar, Befunde in Einzelzellkulturen zu validieren und den Einsatz von Tierversuchen zu reduzieren. Bei Schnittkulturen bleibt die organotypische Gewebestruktur im Gegensatz zur dissoziativen Zellkultur weitgehend erhalten, sodass die Verhältnisse in vivo reduktionistisch simuliert werden können und komplexe Interaktionen glialer Zellen ohne die Einwirkung peripherer Entzündungszellen studiert werden können. Schnittkulturen bieten zudem die Möglichkeit einer gezielten, beispielsweise pharmakologischen, Manipulation der Kulturbedingungen und der einfachen Visualisierung daraus resultierender Effekte. Ein Vorabscreening möglicher therapeutischer Kandidaten ist so ohne den Einsatz von Tierversuchen möglich.

In unserer Arbeitsgruppe sind Methoden etabliert, die eine Herstellung von Schnittkulturen post-mortem erlaubt. Die Entnahme von Gehirn bzw. Rückenmark erfolgt unter sterilen Bedingungen im Rahmen einer Obduktion der Tiere. Mittels eines Gewebehackers oder alternativ mittels eines Vibratoms werden 350 µm breite Gewebescheiben hergestellt, die dann auf geeigneten Membraneinsätzen unter Zugabe eines geeigneten Zellkulturmediums kultiviert werden. Die Schnittkulturen werden daraufhin nach einer festgelegten Kultivierungszeit Formalin-fixiert und anschließend histologisch, immunhistologisch und/oder molekularbiologisch untersucht. Die Herstellung von zahlreichen Schnittkulturen von einem Tier erlaubt die gleichzeitige Durchführung von mehreren Versuchen und geht mit einer deutlichen Reduzierung der Anzahl der Tiere einher, die für In vivo-Studien notwendig wären.

Projektbeschreibung:
Die zukünftigen Forschungsvorhaben in unserer Arbeitsgruppe basieren auf bereits publizierten Beobachtungen an kaninen und murinen Schnittkulturen. Da die Schnittpräparation selbst ein Trauma simuliert, können zeitliche Veränderungen im Gewebe als Modell für Prozesse nach einem Neurotrauma angesehen werden. So wurden bereits organotypische Schnittkulturen vom Rückenmark adulter Hunde als ergänzendes Modell für Prozesse im verletzten kaninen Rückenmark etabliert, das sich durch eine ausgeprägte, mit der Situation in vivo vergleichbare Antwort phagozytotisch aktiver Mikroglia/Makrophagen auszeichnet (Spitzbarth et al., 2011; Bock et al., 2013). Darüber hinaus konnten wir in weiteren Studien zeigen, dass die Kultivierung von Schnitten des kaninen Bulbus olfactorius und des Hirnstamms sowie auch die Kultivierung unterschiedlicher Lokalisationen des Gehirns adulter Mäuse mit einer spontanen Proliferation p75-Neurotrophin-Rezeptor (p75NTR)-positiver, möglicherweise regenerationsfördernder Schwann Zell-ähnlicher Gliazellen einhergeht (Imbschweiler et al., 2012; Spitzbarth et al., 2015; Kegler et al., 2015). Weiterhin wurde in ersten Vorabstudien gezeigt, dass sich Schnittkulturen des adulten Hundegehirns mit Staupevirus infizieren lassen, sodass sich dieses In vitro-Modell auch als geeignet erweist, bestimmte Aspekte der Staupevirus-Leukoenzephalitis tierversuchsunabhängig zu untersuchen (Lempp et al., 2014).

In zukünftigen Forschungsvorhaben soll die Interaktion zwischen möglicherweise regenerationsfördernden Schwann Zell-ähnlichen Gliazellen mit Mikroglia/Makrophagen näher untersucht werden, um potenzielle Auslösefaktoren zu identifizieren, die eine Proliferation p75NTR-positiver Glia fördern. Hierfür können auch Pharmaka zur Manipulation der Kulturbedingungen eingesetzt werden (z.B. Minozyklin zur Unterdrückung der Mikroglia/Makrophagen-Aktivierung). Analog sollen Hirnschnittkulturen von Hunden mit Staupevirus infiziert werden, die Zielzellen der Infektion charakterisiert werden und die Befunde mit nicht-infizierten Kontrollschnitten vergleichend evaluiert werden, um so Erkenntnisse über die Pathogenese glialer Veränderungen bei der Staupevirus-Leukoenzephalitis zu erlangen.

Projektverantwortliche:
Prof. Dr. W. Baumgärtner, Ph.D. (wolfgang.baumgaertner(at)tiho-hannover.de; Tel.: 0511-953 8620)
Prof. Dr. A. Beineke (andreas.beineke(at)tiho-hannover.de; Tel.: 0511-953 8640)
Institut für Pathologie

 

MoNLight-BoNT-Assay

MoNLight-BoNT-Assay - Entwicklung eines Serotyp-unabhängigen Botulinum Neurotoxin-Aktivitätstest zur Chargentestung

Methoden:

  • Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zu Motoneuronen
  • RT-qPCR, Western Blot, Lumineszenz-Assay

Projektbeschreibung:

Botulinum Neurotoxine (BoNTs) werden zur Behandlung einer Reihe von neuromuskulären Fehlfunktionen sowie in der ästhetischen Medizin als Therapeutikum eingesetzt. Jede Charge pharmakologischer Zubereitungen dieser hoch potenten, von Clostridium botulinum-Bakterienstämmen produzierten, Neurotoxine muss auf ihre Aktivität überprüft werden. Obwohl Alternativen existieren, wird ihre Aktivität immer noch zu einem großen Anteil über den Maus-Letalitäts-Test bestimmt. Bisher zugelassene Ersatzmethoden sind ausschließlich für einzelne Präparate anwendbar, da hier hoch spezifische Neoepitop-Antikörper zum Nachweis der proteolytischen Aktivität der kleinen Untereinheit von BoNTs angewendet werden. Für die Chargentestung von BoNTs werden jährlich allein innerhalb Europas immer noch 400.000 Mäuse eingesetzt (Stand 2018). Neue Produkte, die ausschließlich im Tier getestet werden, werden von der Europäischen Arzneimittel-Agentur (EMA) nicht mehr akzeptiert. Mittlerweile sind neben den BoNT-Serotypen A-H über 40 Subtypen und Mosaikvarianten bekannt. Der pharmakologische Einsatz diverser Subtypen und neuer Produkte ist in Zukunft wahrscheinlich, da Resistenzen gegenüber einzelnen Produkte entstehen können. Ein Serotyp-unabhängiger, Tier-freier Assay, welcher für die Aktivitätstestung von BoNT-enthaltenden pharmakologischen Produkten übergreifend eingesetzt werden kann, existiert bisher noch nicht, wird aber dringend benötigt.

Der MoNLight-BoNT Assay (Motor Neuron Light-BoNT Assay) basiert auf aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) differenzierten Motoneuronen (MNs). Die Aktivität der pharmakologischen BoNT-Produkte ist invers proportional zur Freisetzung eines Reporterenzyms (Luciferase) aus den Neurotransmitter-haltigen Vesikeln der MNs. Der Assay ist Serotyp-unabhängig und wäre daher eine geeignete Ersatzmethode, um den mit der Chargentestung verbundenen Maus-Letalitäts-Test vollständig zu ersetzen (Replace im Kontext der 3R).

Testprinzip MoNLightBoNT Assay

Förderung:
Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; FKZ 031L0132B, 2017-2020)

Projektverantwortliche:
Prof. Bettina Seeger, PhD (bettina.seeger(at)tiho-hannover.de; 0511-856-7602)
Maren Schenke, Ph.D. (maren.schenke(at)tiho-hannover.de 0511-856-7603)
Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit

Netzwerk-Meta-Analysen an Omics-Studien

Netzwerk-Meta-Analysen für indirekte Inferenz aus publizierten Omics-Studien

Methoden:

  • Wissensextraktion aus publizierten Studien und Daten
  • Vermeidung von Tierversuchen durch indirekte Inferenz aus existierenden Ergebnissen
  • Zusammenführen von Studienergebnissen mit Methoden des Data Science
  • Methoden zur Simulation hochdimensionaler Datenstrukturen

Projektbeschreibung:
Aus bereits vorhandenen Studienergebnisse können mittels Netzwerk-Meta-Analysen indirekte Gruppenvergleiche angestellt werden, d.h. Gruppenvergleiche, die in den Originalstudien noch nicht untersucht wurden. Dadurch können weitere Tierversuche vermieden werden. In diesem Projekt wird untersucht, wie die Netzwerk-Meta-Analyse auf hochdimensionale Daten aus „Omics“-Experimenten (z.B. Transkriptom-, Proteom- oder Metabolom-Profile) angewendet werden kann. Es wird ferner erforscht, wie aus bereits öffentlichen, experimentellen Omics-Daten neues Wissen durch Methoden der Mustererkennung extrahiert werden kann.

Daneben werden Verfahren entwickelt, um allgemein hoch-dimensionale Daten simulieren zu können. Diese Verfahren können dazu beitragen, Transkriptom-, Proteom- oder Metabolom-Studien am Computer simulieren zu können.

Projektverantwortlicher:
Prof. Dr. Klaus Jung (klaus.jung(at)tiho-hannover.de; 0511-953-8878)
Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung

Primäre Zell- und Organkulturen von Geflügelspezies

Epitheliale Zellen als Zielzellen für Infektionserreger: Primäre Zell- und Organkulturen als Ergänzung oder Ersatz zu Tierversuchen

Projektbeschreibung:
An der Klinik für Geflügel werden im Rahmen unterschiedlicher Studien Zoonoseerreger wie das aviäre Influenzavirus (AIV) sowie Campylobacter spp. aber auch geflügelspezifische Erreger wie das aviäre Metapneumovirus, Bordetella avium oder Mycoplasma gallisepticum untersucht. Epitheliale Zellen des Respirations-, Darm- oder Geschlechtstraktes sind Zielzellen für diese Erreger. Untersuchungen zu Erreger-Wirt-Interaktionen an diesen Zielzellen, insbesondere auch im Rahmen von Co-Infektionen, würden unter in vivo-Bedingungen sehr umfangreiche Tierversuche erfordern.

Teilziele unserer Forschungsvorhaben sind, die Erreger-Wirt-Interaktionen an epithelialen Zellen besser zu verstehen, speziesspezifische Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Nutzgeflügelspezies herauszuarbeiten und Ansätze zu finden, diese unterschiedlichen Erreger im Feld besser kontrollieren zu können. Wir haben dafür in unserer Arbeitsgruppe primäre Zell- und Organkultursysteme etabliert, um unter gut standardisierbaren Bedingungen unter Vermeidung bzw. Reduktion von Tierversuchen Erreger-Wirt-Interaktionen untersuchen zu können. Diese Organ- und Zellkulturen umfassen Systeme repräsentativ für den Legedarm, die Trachea sowie unterschiedliche Abschnitte des Darmtraktes. Die Zell- und Organkulturen können von unterschiedlichen Vogelspezies gewonnen werden, was eine Untersuchung der Erregerpathogenese in vitro und Erreger-Wirtinteraktionen zwischen verschiedenen Tierarten zeitgleich unter vergleichbaren Laborbedingungen ermöglicht. Der epitheliale Charakter dieser Zell- und Organkulturen bleibt über mehrere Tage erhalten, und es kann beispielweise die mikroskopische Untersuchung des Zilienschlags als ein Parameter zur Erfassung der Erregereinwirkung herangezogen werden. Weiterhin werden Techniken wie die qRT-PCR eingesetzt zur Untersuchung von angeborenen Immunreaktionen nach der Infektion. Die Replikation der jeweiligen Erreger wird erfasst durch klassische virologische oder bakteriologische aber auch molekularbiologischen Methoden.

Projektverantwortliche:
Prof. Dr. Silke Rautenschlein (silke.rautenschlein(at)tiho-hannover.de; 0511-953-8779)
Dr. Arne Jung (arne.jung(at)tiho-hannover.de 0511-953-8774)
Klinik für Geflügel

Regulationsmechanismen von P-Glykoprotein an Hirnendothelzellen

Regulationsmechanismen von P-Glykoprotein an Hirnendothelzellen verschiedener Spezies und neue In vivo-Ansätze zur Translation von In vitro-Befunden

Methoden:

  • Verwendung von In vitro-Blut-Hirn-Schranke-Modellen zur Untersuchung Arzneimitteltransporter vermittelter Regulationsmechanismen

Projektbeschreibung:
Angesichts der Pharmakoresistenz von häufigen Hirnerkrankungen wie Epilepsie oder Depressionen gegenüber gängigen Therapieverfahren und der potentiellen Bedeutung von Efflux-Transportern wie P-Glykoprotein (Pgp) für Resistenzmechanismen sind die Entschlüsselung der Regulationsmechanismen von Pgp an der Blut-Hirn-Schranke (BHS) sowie die Suche nach innovativen Therapieeinsätzen, von grundlegender Bedeutung. Um schnelle, auf Anfrage reagierende Regulationsmechanismen des Efflux-Transporters Pgp an der menschlichen BHS für Arzneimittelwirkung zu untersuchen wurde die humane Hirnkapillarendothelzelllinie hCMEC/D3 mit MDR1-EGFP transduziert, um Pgp sichtbar zu machen. In diesem in-vitro-BHS-Modell wird der Zell-Zell-Pgp-Transfer und die intrazelluläre Pgp-vermittelte Substratsequestrierung untersucht. Sequestrierte Arzneimittel werden von der Zelle in Form von extrazellulären Vesikeln abgegeben, die sich an Blut-zugewandten Zellmembran anlagern und durch Interaktion mit Blutzellen entsorgt werden. Die Bedeutung dieser neuen Mechanismen soll vergleichend mit anderen Pgp-Regulationsmechanismen an hCMEC/D3-Zellen, sowie Hirnendothelzellen anderer Spezies in vitro untersucht werden. In diesem Zusammenhang sollen die verschiedenen in-vitro-BHS-Modelle charakterisiert und optimiert werden. Unter anderem soll der Einfluss des Tight Junction Proteins Claudin-5 auf die Barriere-Eigenschaften in dem humanen hCMEC/D3 Modell untersucht werden. Mittels verschiedener Ex vivo-Methoden soll die In vivo-Relevanz der Pgp-Regulationsmechanismen evaluiert werden. Wir erwarten von unseren Untersuchungen die Charakterisierung neuer speziesübergreifender oder -spezifischer Regulationsmechanismen von Pgp an der BHS und damit die Möglichkeit des pharmakologischen Eingriffs in Resistenzmechanismen von Hirnerkrankungen.  

Projektverantwortlicher:
Prof. Dr. Wolfgang Löscher (wolfgang. loescher(at)tiho-hannover.de; Tel. 0511-953-8729)
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

SALMHEARTCELL

SALMHEARTCELL - Entwicklung und Nutzung von primären und permanenten Zellkulturen aus salmoniden Herzzellen zur Replikation und zum Nachweis von piscinen Orthoreoviren

Projektbeschreibung:
Das Projekt SALHEARTCELL zielt auf die Entwicklung neuer mariner Ressourcen ab, indem primäre Kulturen von Salmoniden-Herzzellen (SalCPCs) und permanente Zellkulturen aus dem Herzgewebe von Atlantischem Lachs (Salmo salar), Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) und Bachforelle (Salmo trutta) gezüchtet und diese Zellen in Studien über neu auftretende Viren, die bei Salmoniden Durchblutungsstörungen verursachen, genutzt werden. Dies soll durch die Expertise und Zusammenarbeit der Partner Fraunhofer-Forschungseinrichtung für Marine Biotechnologie und Zelltechnologie (EMB) und der Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung der Tierärztlichen Hochschule Hannover (TiHo) erreicht werden. Die Kulturen und Zelllinien werden gründlich charakterisiert und in Versuchen zur Replikation und zum Nachweis der Piscinen Orthoreoviren 1 und 3 (PRV-1 und PRV-3) verwendet. Diese bei Fischen neu auftretenden Krankheitserreger wurden kürzlich auch in Deutschland nachgewiesen und bedrohen damit deutsche aquatische Meeresressourcen unmittelbar. PRV-1 und PRV-3 infizieren Kardiomyozyten und Erythrozyten. Trotz verschiedener Versuche scheiterte die Kultivierung dieser Viren in bestehenden Zelllinien. Dies beeinträchtigt die Krankheitsdiagnostik, die Erforschung der Viren und die Entwicklung von Impfstoffen, die die Bedrohung mildern könnten, erheblich. SalCPCs enthalten spontan kontrahierende Myozyten, die zu den Zielzellentypen von PRV-1 und PRV-3 gehören. Die Weiterentwicklung von Zellkulturen könnte ein sehr wertvolles Werkzeug für weitere Studien an Salmoniden und an Herzgewebe im Allgemeinen sein. Die Kultivierung von PRV-1 und PRV-3 wird von externen Partnern aus Norwegen, Kanada und Dänemark unterstützt und zielt darauf ab, einen Nachweis zur Machbarkeit für SalCPCs als Testsystem in der PRV-1- und PRV-3-Forschung zu erbringen. Dies Projekt kann einen bedeutenden Fortschritt in der Erforschung von Herzzellen bringen und die Verbreitung von PRVs in Salmonidenpopulationen verhindern.

Förderung:
SALHEARTCELL, Bundesministerium für Bildung und Forschung, 2020 – 2023

Projektverantwortliche:
Dr. Mikolaj Adamek (mikolaj.adamek(at)tiho-hannover.de, 0511-953-8579)
Institut für Parasitologie, Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung

Sauerstoff-abhängige Differenzierung von Mastzellen

Etablierung einer Sauerstoff-abhängigen Methode zur effizienten Differenzierung von Mastzellen aus dem Blut von Mensch und Tier

Methoden:

  • Knochenmarks-abstammende Mastzellen aus der Maus

Projektbeschreibung:
Mastzellen sind wichtige Bestandteile des Immunsystems. Sie sind vor allem für ihre Rolle bei der Entstehung von allergischen Reaktionen bekannt. In den letzten Jahren ist jedoch zunehmend bekannt geworden, dass sie auch bedeutend bei der Abwehr von Infektionen sind. Sie können eine Vielzahl von antimikrobiellen Substanzen generieren und im Kampf gegen parasitäre, virale und auch bakterielle Erreger aktiv werden. Daher werden Mastzellen auch zunehmend als ein vielversprechendes Angriffsziel für therapeutische Anwendungen gegen Infektionskrankheiten diskutiert. Leider ist der Zugang zu Mastzellen zu Forschungszwecken sehr limitiert. Verfügbare permanente Zelllinien zeigen abweichende physiologische Funktionen im Vergleich zu primären Zellen. Primäre Zellen lassen sich leider technisch nur sehr schwer, kostenaufwendig und mit limitierender Ausbeute aus dem Blut oder der Nabelschnur isolieren. Eine gute Quelle, die meistens für Forschungszwecke als Alternative eingesetzt wird, sind Knochenmarks-abstammende primäre Mastzellen aus der Maus. Leider ist auch hier die Ausbeute pro Maus limitiert, so dass für eine effiziente Gewinnung von Mastzellen relativ hohe Tierzahlen nötig sind. Optimierte Protokolle für die Isolierung und Differenzierung von primären Mastzellen sind von Nöten, um die Immunantwort von Mastzellen bei Allergie und Infektion vor allem auch Tier- bzw. humanspezifisch besser charakterisieren zu können.

Im Gegensatz zu den übrigen Leukozyten verlassen Mastzellen das Knochenmark nicht als ausgereifte Zellen, sondern zirkulieren als Vorläuferzellen im Blut. Die Mastzellen werden spezifisch in die entsprechenden Gewebe rekrutiert, wo sie schließlich unter dem Einfluss der lokalen Bedingungen wie z.B. vorhandenen Zytokinen zu Mastzellen differenzieren und ausreifen. Basierend auf eigenen Vorversuchen der Antragstellerin mit Knochenmark-abstammenden murinen Mastzellen wird die Hypothese aufgestellt, dass physiologisch relevante Sauerstoffbedingungen, die je nach Gewebe deutlich unter normoxischen Bedingungen (atmosphärischen Bedingungen von 21% Sauerstoff) liegen, die Differenzierung und somit Ausbeute, sowie funktionellen Eigenschaften von differenzierten Mastzellen aus Vorläuferzellen beeinflussen. In diesem Projekt soll daher der Einfluss von definierten Sauerstoffbedingungen auf die Differenzierung von Mastzellen aus dem Blut vom Mensch und Schwein untersucht werden, mit dem Ziel ein effizientes Differenzierungsprotokoll mit erhöhter Mastzellausbeute aus dem Blut unter definierten Sauerstoffbedingungen zu entwickeln. Außerdem sollen verschiedene Zellkulturzusätze (Zytokine, Seren etc.) auf den Einfluss der Ausbeute untersucht werden. Die primären Zellen sollen hinsichtlich Zellfunktion, Expression zell-typspezifischer Marker, Membranzusammensetzung sowie antimikrobieller Aktivität gegen pathogene Erreger charakterisiert werden.

Projektverantwortliche:
Prof. Dr. Maren von Köckritz-Blickwede (maren.von.koeckritz-blickwede(at)tiho-hannover.de; 0511-953-8787)
Institut für Biochemie & Research Center for Emerging Infections and Zoonoses (RIZ)

The Niedersachsen Live-Tissue and primary cell Bio-Bank (NLTB)

The Niedersachsen Live-Tissue and primary cell Bio-Bank (NLTB)

Projektbeschreibung:
Das NLTB-Projekt zielt darauf ab, die neuesten Forschungsfortschritte, die bei der Untersuchung von Wirt-Pathogen- und Wirt-Allergen-Interaktionen gemacht wurden, mit der präklinischen Erprobung von präventiven und therapeutischen Werkzeugen zu verknüpfen, um alternative Methoden zu Tierversuchen effektiv umzusetzen. Viele technologische Fortschritte in der Grundlagen- und Basisforschung können wesentlich zu erfolgreichen Alternativen zu Tierversuchen beitragen. Solche technologischen Fortschritte müssen jedoch im Hinblick auf eine standardisierte und reproduzierbare Anwendung, Qualitätssicherung und Technologietransfer entwickelt werden. Um darauf hinzuarbeiten, diese Lücken zu schließen, wird das NLTB ein Repository mit Protokollen, Techniken und einer Biobank von in vitro und ex vivo Atemwegszellen und -geweben aufbauen und pflegen, um diese auf Abruf bereitzustellen und zu nutzen. Das von der NLTB generierte Material wird primäre und immortalisierte Zellkulturen, Luft-Flüssigkeits-Interface-Kulturen (ALI), tracheale Organkulturen (TOC) und präzisionsgeschnittene Lungenschnitte (PCLS) umfassen, die von einer Vielzahl von Spezies stammen. Die Proben werden opportunistisch in Schlachthöfen, von Haustieren, die aus nicht verwandten Gründen eingeschläfert wurden, von überzähligen Versuchstieren und von Menschen, die einer Lungenoperation unterzogen wurden, gesammelt.
Komplexe Interaktionen zwischen Pathogenen oder Allergenen und den Abwehrmechanismen des Wirts sind entscheidende Determinanten für den Verlauf und die Schwere von Infektionen und allergischen Reaktionen, den Krankheitsverlauf und die Aktivierung der angeborenen und adaptiven Immunantwort. Die Reproduktion dieser Interaktionen im Labor, so wie sie in vivo stattfinden, ist essentiell für das Verständnis der Pathogenese von Infektionen und Allergien sowie für das präklinische Screening und die eventuelle Prüfung der Wirksamkeit von therapeutischen und präventiven Medikamenten. Solche Studien beruhen typischerweise auf dem umfangreichen Einsatz von Labortieren, die die nächstliegenden Modelle für Infektionen oder Allergien darstellen, die Komplexität der Interaktionen nachahmen und dennoch auf die Generierung reproduzierbarer Daten abzielen. Das daraus resultierende tiefgreifende Verständnis dieser Wechselwirkungen ist die Grundlage für die rationale Entwicklung von therapeutischen und präventiven Medikamenten, die auf kritische Schritte im Lebenszyklus des Erregers, allergische Sensibilisierung und schädliche Wirtsreaktionen abzielen.
Wie bei toxikologischen Studien verspricht die Verwendung von in vitro oder ex vivo Systemen, wie primäre und/oder immortalisierte Zellkulturen und Zelllinien, Organkulturen und Gewebe-Kokulturen, die Reduzierung oder sogar den Ersatz von Versuchstieren in der Pathogenese, beim Wirkstoffscreening und bei der Qualitätskontrolle. Ihr multireplizierter Einsatz bietet den zusätzlichen Vorteil einer hohen statistischen Aussagekraft und besseren Reproduzierbarkeit als der Einsatz von Versuchstieren. Die Vielfalt an primären und/oder immortalisierten Zellkulturen, Zelllinien und diese über Organsysteme und Tierarten hinweg muss erweitert werden. Darüber hinaus müssen bestehende in vitro und ex vivo Systeme verglichen werden, um die besten Protokolle und Ansätze für vordefinierte Forschungsziele zu evaluieren. Zum Beispiel sind PCLS ein potentes ex vivo differenziertes Epithelzellmodell für die tierische und menschliche Lunge: sie (i) können in großer Zahl gewonnen werden, (ii) bleiben weitgehend in ihrer ursprünglichen Umgebung erhalten, (iii) sind mehr als eine Woche lang lebensfähig, (iv) zeigen charakteristische Funktionen des Respirationstraktes wie Schleimproduktion, ziliäre Aktivität und Bronchokonstriktion. Die Anwendung der PCLS hat sich von der Prüfung funktioneller Reaktionen, wie Atemwegs- und Vasokonstriktion, auf pharmakologische und toxikologische Tests bei verschiedenen Spezies ausgeweitet. Sie wurde jedoch nur begrenzt in der Grundlagenforschung eingesetzt, z. B. zur Aufklärung der Kalzium-Signalübertragung, früher allergischer Reaktionen und Reaktionen auf virale Infektionen.
Andere In-vitro-Atemwegssysteme umfassen ALI-Kulturen und differenzierte Epithelzellen und Zelllinien der Atemwege. Obwohl es sich hierbei um allgemein akzeptierte und validierte Systeme zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen handelt, muss ihre Relevanz für den Ersatz von Versuchstieren weiter evaluiert werden.

Zu diesem Zweck wird das NLTB die folgenden Ziele verfolgen:

  • Etablierung von standardisierten Protokollen für die Generierung von (immortalisierten) primären respiratorischen Zellkulturen, ALI-Kulturen, TOC und Mikrotom-PCLS von geschlachteten Tieren (Geflügel, Schwein, Rind), aus nicht verwandten Gründen euthanasierten Haustieren sowie von überzähligen Versuchstieren (Geflügel, Nager, Frettchen, Affen) und aus der Humanchirurgie
  • Etablierung von standardisierten Protokollen für die Kryokonservierung von immortalisierten Zellkulturen, TOC und PCLS
  • Etablierung und Aufrechterhaltung der NLTB

Zusammengefasst zielt die NLTB auf die Etablierung und Validierung von Protokollen und Ansätzen zum Ersatz und zur Reduzierung von Tierversuchen durch die Erweiterung der Verfügbarkeit und Vielfalt von lebenden Geweben und Zelllinien für die Erforschung von Atemwegsinfektionen und chronischen Atemwegserkrankungen bei Mensch und Tier. Die langfristige Lagerung von Zellen und Geweben wird die Planung und Durchführung von Experimenten erleichtern und eine einfache Verteilung von Geweben ermöglichen. Das NTLB wird auf einer koordinierten und effizienten Logistik für die Erzeugung und/oder Konservierung von lebenden Geweben und Zellkulturen aufbauen, die die Lieferung und Verwendung von In-vitro- und Ex-vivo-Geweben bei Bedarf ermöglicht.

Förderung:
R2N, Niedersächsisches Ministerium für Wissenschaft und Kultur

Projektverantwortlicher:
Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, PhD (wolfgang.baumgaertner(at)tiho-hannover.de; 0511-856-8620)
Institut für Pathologie

Transdermalen Permeation, Penetration und Resorption

In vitro- und Ex vivo-Untersuchungen zur transdermalen Permeation, Penetration und Resorption

Methoden:

  • Franzzell-Diffusionsversuche
  • Isoliert perfundiertes Rindereuter

Projektbeschreibung:
Zur Entwicklung und Erprobung von dermal anzuwendenden Arzneiformen (z.B. Spot-on-Präparate) werden In vitro- als auch Ex vivo-Modelle genutzt, um eine Vorauswahl an geeigneten Formulierungen oder Testsubstanzen zu treffen. Hierfür stehen sowohl Diffusionszellen nach Franz (In vitro-Modell) als auch das in der Arbeitsgruppe etablierte Modell des isoliert perfundierten Rindereuters (Ex vivo-Modell) zur Verfügung.

Projektverantwortliche:
Dr. Jessica Meißner (jessica.meissner(at)tiho-hannover.de; 0511-953 8723)
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

Veränderter Protein- und Lipidtransport in intestinalen Epithelzellen

Untersuchungen zum veränderten Protein- und Lipidtransport in stabilen Zelllinien nach Kontakt mit toxischen Substanzen als Ursache pathologischer Zustände

Methoden:

  •  polare intestinale Epithelzellen

Projektbeschreibung:
Zur Entwicklung einer wirksamen Therapie bei entzündlichen Darmerkrankungen bei Säugetieren, ausgelöst durch genetische Faktoren oder durch die Aufnahme toxischer Substanzen über die Nahrung, ist eine genaue Kenntnis der biochemischen und physiologischen Prozesse in den betroffenen Epithelzellen des entzündeten Darmabschnitts unerlässlich. Ein Verständnis der Epithelzellen im pathologischen Zustand ist dabei genauso wichtig wie z. B. dasjenige der Morphologie der Zellmembran und ihrer Komponenten im gesunden Darm. Am Caco-2-Zellmodell sollen die grundlegenden Interaktionsmöglichkeiten zwischen toxischen Substanzen aus Nahrungsmitteln und Epithelzellen charakterisiert werden. Es soll das Augenmerk auf Ursache-Wirkungs-Analysen der Adhäsion der Substanzen, ihrer Endocytose, und ihres Traffickings innerhalb der Epithelzellen gelegt werden. Die humane colorectale Zelllinie Caco-2 ist seit langem ein wissenschaftlich anerkanntes Modell für intestinale Zellen, das in vielen Eigenschaften der Membrantopologie, der Zellbiochemie und des Transportes denjenigen physiologisch unauffälliger Mucosazellen des Darms entspricht. Durch die spezielle Kultivierung in Snap-Well-Einsätzen lässt sich die apikale/darmlumenseitige Aufnahme von Substanzen simulieren und die basolaterale/gewebeseitige Abgabe von Stoffwechselprodukten analysieren. Zusätzlich werden die behandelten Zellen biochemisch und zellbiologisch auf pathologische Veränderungen untersucht.

Projektverantwortliche:
Prof. Dr. Hassan Y. Naim (hassan.naim(at)tiho-hannover.de; 0511-953-8787)
Institut für Biochemie

Viral-bakterielle Co-Infektionen des respiratorischen Epithels

Viral-bakterielle Co-Infektionen des respiratorischen Epithels von Schweinen

Methoden:
Kultivierung von porzinen Atemwegsepithelzellen unter Air-liquid interface-Bedingungen. Nach der Entfernung des Mediums von der apikalen Seite differenzieren die Zellen zu unterschiedlichen Zelltypen. Lungenpräzisionsschnitte von der Schweinelunge. Mit diesem System können die Zellen in ihrer ursprünglichen Organisationsform untersucht werden.

Projektbeschreibung:
Virusinfektionen der Atemwege nehmen häufig einen schwereren Verlauf, wenn eine bakterielle Begleitinfektion hinzukommt. Ein bekanntes Beispiel ist die spanische Grippe von 1918/19, bei der die Infektion durch das Influenzavirus des H1N1-Subtyps in vielen Fällen erst dann einen tödlichen Verlauf nahm, wenn noch eine bakterielle Infektion auftrat, häufig durch . Wir nutzen ex vivo-Modelle von Atemwegszellen, um die Co-Infektion von porzinen respiratorischen Epithelzellen durch Influenzaviren und Streptokokken zu untersuchen. Wir analysieren, wie die beiden Erreger sich gegenseitig beeinflussen und den Infektionsverlauf ändern.

Förderung:
DFG

Projektverantwortliche:
Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand (peter.valentin-weigand(at)tiho-hannover.de; 0511-953-7362)
Institut für Mikrobiologie

Virusinfektionen in Mensch und Tier

In vitro- und Ex vivo-Charakterisierung von Virusinfektionen in Mensch und Tier

Projektbeschreibung:
In der Infektionsforschung der Atemwegserkrankungen wird eine erhebliche Anzahl an Versuchstieren verwendet. In der Influenzaforschung sind Frettchenexperimente noch immer der Goldstandard für Viruspathogenitäts- und Interventionsstudien, da quantitative Parameter des Krankheitsverlaufes durch die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen Virus und Wirt bestimmt werden. Die Entwicklung von Ex vivo-Parametern als validierte Alternative zu solchen in vivo ist vielversprechend für die Reduzierung der in der Infektionsforschung verwendeten Tiere. Wir haben das Ziel quantitative Parameter der Influenzaviruspathogenität in Präzisionslungengewebsschnitten (PCLS) als alternative Methode zu etablieren, um Viruspathogenese und Arzneimittelwirksamkeit zu untersuchen.

Förderung:
R2N, Niedersächsisches Ministerium für Wissenschaft und Kultur, 2017-2021

Projektverantwortlicher:
Prof. Albert Osterhaus, Ph.D., (albert.osterhaus(at)tiho-hannover.de, 0511-856-6140)
Research Center for Emerging Infections and Zoonoses (RIZ), Division of Virology

 

Zelldifferenzierung in intestinalen Organoiden

Zelldifferenzierung und Selbsterneuerung in porzinen intestinalen Organoiden

Methoden:

  • Isolation von intestinalen Stammzellen vom Schwein und Generierung porziner intestinaler Organoide

Projektbeschreibung:
Das Schwein ist ein wichtiges Modell für die Erforschung humaner Magen-Darm-Erkrankungen, da große Ähnlichkeiten zwischen beiden Spezies bestehen. Es gibt allerdings auch artspezifische Unterschiede in pathophysiologischen Prozessen, wie z. B. bei der Infektion mit Yersinia enterocolitica, die beim Menschen zu einer Gastroenteritis führt, während Schweine asymptomatisch bleiben. Intestinale Organoide sind in den letzten Jahren zu wichtigen Werkzeugen geworden, um die zugrundeliegenden Mechanismen zu untersuchen. Während der Langzeitkultur wird vor allem die Expression von proliferierenden intestinalen Stammzellen hochreguliert, um die Selbsterneuerung und Proliferation der Organoide zu unterstützen. Um Modelle zur Untersuchung molekularer Mechanismen während bakterielle Infektionen zur generieren, ist es das Ziel dieser Studie, die Expression von spezialisierten Darmepithelzellen, wie M-Zellen, Becherzellen und enteroendokrinen Zellen in porzinen intestinalen Organoiden anzureichern.

Förderung: Unterstützt durch ein Promotionsstipendium von der H. Wilhelm Schaumann Stiftung (01/2020-12/2021).

Projektverantwortliche:
Prof. Bettina Seeger, Ph.D. (bettina.seeger(at)tiho-hannover.de, 0511-956-7602)
Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit

Zellkultursystem zur Untersuchung der Hepatitis E-Virus (HEV)-Infektion

Etablierung eines reversen genetischen Systems zur Untersuchung molekularer Mechanismen der Hepatitis E-Virus (HEV)-Infektion

Methoden:

  • Etablierung eines Zellkulturmodells für Hepatitis E-Virus (HEV, Genotyp 3)
  • Klonierung des Gesamtgenoms von HEV in einen bakteriellen Vektor
  • Etablierung eines reversen genetischen Systems für HEV

Projektbeschreibung:
Seit der Einführung der Meldepflicht für die humane Hepatitis E-Erkrankung  im Jahr 2001 nimmt die Zahl der gemeldeten Krankheitsfälle in Deutschland stetig zu. In Europa führt vor allem HEV Genotyp 3 zu chronisch manifesten Krankheitsbildern bei immunsupprimierten Patienten. Als Reservoirwirt wurde in Europa neben Hirscharten und Schwarzwild vor allem das Hausschwein identifiziert. Viele Aspekte der Pathogenese und Epidemiologie einschließlich der Übertragungsweise vom Tier auf den Menschen sind bislang nur wenig untersucht. Unklar sind zum einen die Mechanismen der unterschiedlichen Virulenzausprägung im Reservoirwirt Schwein sowie im Menschen. Desweiteren liegen bislang keine Studien zu Zellsuszibilität sowie zum zellulären Rezeptor vor. Weiterhin sind große Teile des Vermehrungszyklus von HEV noch nicht untersucht. Dies liegt vor allem daran, dass nur sehr wenige ausgewählte HEV-Stämme in vitro kultivierbar sind und etablierte Zellkulturmodelle bislang nicht zur Verfügung stehen, um die molekularen Grundlagen der HEV-Replikation zu untersuchen. Im Tiermodell (hauptsächlich Schwein) ist die HEV-Infektion hingegen gut charakterisiert.

Ein wichtiges Ziel des Projektes ist die Klonierung des Gesamtgenoms von HEV in einen entsprechenden Vektor, um im Anschluss auf DNA-Ebene verschiedene genetische Veränderungen vornehmen zu können. Nach Umschreiben in RNA wird diese mittels Elektroporation in dafür empfängliche Zellen eingebracht. Auf diese Weise können grundlegende Mechanismen der Virusreplikation und -freisetzung in vitro untersucht werden. Das Projekt beinhaltet die Erarbeitung einer Klonierungsstrategie und deren Durchführung, die Auswahl eines geeigneten Zellkultursystems und die Generierung infektiöser Viruspartikel. Die Etablierung dieses Systems wird detaillierte Studien zu verschiedenen Aspekten der HEV-Infektion in Zellkultur ermöglichen, die bislang nicht oder nur im Tierversuch untersucht werden können, und wird somit zur Reduktion von Tierversuchen beitragen.

Projektverantwortliche:
Christine Bächlein, Ph.D. (christine.baechlein(at)tiho-hannover.de; Tel.: 0511-953-8845),
Prof. Dr. Paul Becher (paul.becher(at)tiho-hannover.de; Tel.: 0511-953-8840)
Institut für Virologie