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Organotypische kanine und murine Schnittkulturen als in vitro-Modell für die Untersuchung glialer Reaktionen und Interaktionen bei neurotraumatischen, -infektiösen, und –degenerativen Erkrankungen des zentralen Nervensystems

Methoden:

Organotypische Schnittkulturen des zentralen Nervensystems sind als intermediäres Modell zwischen Tierversuchen in vivo und Dissoziationskulturen in vitro anzusehen und stellen ein geeignetes Modell dar, Befunde in Einzelzellkulturen zu validieren und den Einsatz von Tierversuchen zu reduzieren. Bei Schnittkulturen bleibt die organotypische Gewebestruktur im Gegensatz zur dissoziativen Zellkultur weitgehend erhalten, sodass die Verhältnisse in vivo reduktionistisch simuliert werden können und komplexe Interaktionen glialer Zellen ohne die Einwirkung peripherer Entzündungszellen studiert werden können. Schnittkulturen bieten zudem die Möglichkeit einer gezielten, beispielsweise pharmakologischen, Manipulation der Kulturbedingungen und der einfachen Visualisierung daraus resultierender Effekte. Ein Vorabscreening möglicher therapeutischer Kandidaten ist so ohne den Einsatz von Tierversuchen möglich.

In unserer Arbeitsgruppe sind Methoden etabliert, die eine Herstellung von Schnittkulturen post-mortem erlaubt. Die Entnahme von Gehirn bzw. Rückenmark erfolgt unter sterilen Bedingungen im Rahmen einer Obduktion der Tiere. Mittels eines Gewebehackers oder alternativ mittels eines Vibratoms werden 350 µm breite Gewebescheiben hergestellt, die dann auf geeigneten Membraneinsätzen unter Zugabe eines geeigneten Zellkulturmediums kultiviert werden. Die Schnittkulturen werden daraufhin nach einer festgelegten Kultivierungszeit Formalin-fixiert und anschließend histologisch, immunhistologisch und/oder molekularbiologisch untersucht. Die Herstellung von zahlreichen Schnittkulturen von einem Tier erlaubt die gleichzeitige Durchführung von mehreren Versuchen und geht mit einer deutlichen Reduzierung der Anzahl der Tiere einher, die für in vivo Studien notwendig wären.

 

Projektbeschreibung:

Die zukünftigen Forschungsvorhaben in unserer Arbeitsgruppe basieren auf bereits publizierten Beobachtungen an kaninen und murinen Schnittkulturen. Da die Schnittpräparation selbst ein Trauma simuliert, können zeitliche Veränderungen im Gewebe als Modell für Prozesse nach einem Neurotrauma angesehen werden. So wurden bereits organotypische Schnittkulturen vom Rückenmark adulter Hunde als ergänzendes Modell für Prozesse im verletzten kaninen Rückenmark etabliert, das sich durch eine ausgeprägte, mit der Situation in vivo vergleichbare Antwort phagozytotisch aktiver Mikroglia/Makrophagen auszeichnet (Spitzbarth et al., 2011; Bock et al., 2013). Darüber hinaus konnten wir in weiteren Studien zeigen, dass die Kultivierung von Schnitten des kaninen Bulbus olfactorius und des Hirnstamms sowie auch die Kultivierung unterschiedlicher Lokalisationen des Gehirns adulter Mäuse mit einer spontanen Proliferation p75-Neurotrophin-Rezeptor (p75NTR)-positiver, möglicherweise regenerationsfördernder Schwann Zell-ähnlicher Gliazellen einhergeht (Imbschweiler et al., 2012; Spitzbarth et al., 2015; Kegler et al., 2015). Weiterhin wurde in ersten Vorabstudien gezeigt, dass sich Schnittkulturen des adulten Hundegehirns mit Staupevirus infizieren lassen, sodass sich dieses In vitro-Modell auch als geeignet erweist, bestimmte Aspekte der Staupevirus-Leukoenzephalitis tierversuchsunabhängig zu untersuchen (Lempp et al., 2014).

In zukünftigen Forschungsvorhaben soll die Interaktion zwischen möglicherweise regenerationsfördernden Schwann Zell-ähnlichen Gliazellen mit Mikroglia/Makrophagen näher untersucht werden, um potenzielle Auslösefaktoren zu identifizieren, die eine Proliferation p75NTR-positiver Glia fördern. Hierfür können auch Pharmaka zur Manipulation der Kulturbedingungen eingesetzt werden (z.B. Minozyklin zur Unterdrückung der Mikroglia/Makrophagen-Aktivierung). Analog sollen Hirnschnittkulturen von Hunden mit Staupevirus infiziert werden, die Zielzellen der Infektion charakterisiert werden und die Befunde mit nicht-infizierten Kontrollschnitten vergleichend evaluiert werden, um so Erkenntnisse über die Pathogenese glialer Veränderungen bei der Staupevirus-Leukoenzephalitis zu erlangen.

 

Projektverantwortliche:

Prof. Dr. W. Baumgärtner, PhD (wolfgang.baumgaertner@tiho-hannover.de; Tel.: 0511-953 8620)

Prof. Dr. A. Beineke (andreas.beineke@tiho-hannover.de; Tel.: 0511-953 8640)

I. Spitzbarth, PhD (Ingo.spitzbarth@tiho-hannover.de; Tel.: 0511-953 8683)

Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

 

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