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Entwicklung eines in vitro-Verfahrens zur Prüfung des neurotoxischen Potenzials von Chemiaklien unter Einsatz von induzierten pluripotenten Stammzellen

Methoden:

  1. verschiedene Differenzierungsprotokolle zur Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) oder neuralen Progenitorzellen und Untersuchung auf Zielgene
  2. Gene Editing per CRISPR/Cas9 zur stabilen Integration eines Reportergenkonstrukts für Gaussia-Luciferase

 

Projektbeschreibung:

 Botulinum-Neurotoxin (BoNT) ist eines der potentesten bekannten bakteriellen Toxine, welches die Neurotransmitterausschüttung an der neuromuskulären Endplatte verhindert und aufgrund dessen eine schlaffe Lähmung der Skelettmuskulatur verursacht. Neben dem durch BoNT verursachten Botulismus, einer gefürchteten Lebensmittelvergiftung, findet BoNT Anwendung in der pharmazeutischen Industrie. BoNT wird zur Behandlung diverser Erkrankungen und besonders in der ästhetischen Chirurgie zur Glättung mimischer Falten, eingesetzt. Zur pharmazeutischen Anwendung wird BoNT aus bakteriellen Kulturen gewonnen. Aufgrund ihrer potenziell extrem stark ausgeprägten Toxizität müssen die einzelnen Chargen auf ihre individuelle Wirksamkeit hin untersucht werden. Beim bisherigen Goldstandard, dem Maus LD50-Test, müssen weltweit jährlich mehrere hunderttausende Tiere eingesetzt werden. Bisher entwickelte immunologische Alternativmethoden sind Serotyp-spezifisch. Allerdings sind bislang acht verschiedene Serotypen von BoNT bekannt. Ein neuer Ansatz, diese Limitierung zu umgehen, besteht darin, Luciferase gezielt in neurosekretorischen Vesikeln von neuronalen Zelllinien zu exprimieren. Eine Depolarisation der Zelle führt somit zur Freisetzung der Luciferase, welche über Luminsezenzmessung quantifiziert werden kann. Durch Applikation von BoNT in pharmakologisch-relevanten Konzentrationen kann die Exozytose der Vesikel und damit die Luciferase-Freisetzung verhindert werden. Dieser Vorgang ist nicht Serotyp-abhängig, was eine Identifikation von BoNT erleichtert und einen Vorteil gegenüber anderen vorhandenen Alternativmethoden darstellt. Bei den bisher genutzten Zelllinien handelt es sich um neuronale Tumorzelllinien. Dieses Forschungsvorhaben zielt darauf ab, das vorhandene Testsystem durch Einsatz von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), die dann mit dem entsprechenden Reportergen transfiziert werden sollen, fortzuentwickeln, um somit ein alternatives, humanrelevantes Testsytem zur Prüfung des neurotoxischen Potenzials von BoNT und seinen Serotypen zu entwickeln.

 

Förderung:

MoNLight-BoNT, Bundesministerium für Bildung und Forschung

 

Projektverantwortliche:

Prof. Bettina Seeger, PhD (bettina.seeger@tiho-hannover.de; 0511-856-7602)

Institut für Lebensmitteltoxikologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Maren Schenke, Ph.D. (maren.schenke@tiho-hannover.de 0511856-7603)

Institut für Lebensmitteltoxikologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

 

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