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Molekularbiologische Forschung

Lasergestützte Transfektion von Stammzellen

Die Bedeutung hämatopoetischer Stammzellen in der Tumorimmuntherapie hat in den vergangenen Jahren stark zugenommen, wobei der Einsatz genetisch veränderter Zellen großes Potential bietet. Die Transfektion hämatopoetischer Stammzellen mit konventionellen Transfektionstechniken ist jedoch schwierig und die erreichten Effizienzen sind gering. Mit Hilfe ultrakurzer Laserpulse (fs-Pulse) können zelluläre Strukturen mit einer Genauigkeit im sub-µm-Bereich bearbeiten werden. Erste Untersuchungen haben gezeigt, dass diese Technologie eine in vitro Transfektion verschiedener epithelialer Säugetierzelllinien mit einer Effizienz um 60-70% ermöglicht, jedoch ist die Anwendung auf einzelne Zellen limitiert. Die Anwendung und Untersuchung dieser Technologie bei hämatopoetischen Stammzellen, welche die Möglichkeit zur Expansion und Differenzierung post transfectionem haben, erscheint, besonders vor dem Hintergrund der begrenzten Verfügbarkeit und der aufwändigen Gewinnung von hämatopoetischen Stammzellen, extrem interessant.
Im Rahmen des Sonderforschungsbereiches SFB / Transregio 37 mit dem Titel „Mikro- und Nanosysteme in der Medizin – Rekonstruktion biologischer Funktionen“ konnten im Teilprojekt A2 „Lastergestützte Transfektion von Stammzellen“ erfolgreich grundlegende und weiterführende Untersuchungen zur Entwicklung einer differenzierten Tumortherapie bearbeitet werden.
In Anlehnung an diese Arbeiten sollen in diesem Projekt mittels hocheffizienter Nanopartikel Lasertechnologie canine hämatopoetische Stammzellen mit immun-modulatorischen Molekülen (IMM ) (Nukleinsäuren/Proteinen) transfiziert und zu High Mobility Group Box 1 Protein (HMGB1) exprimierenden Dendritische Zellen (DZ) differenziert werden.
Die bisherigen Transfektionsstrategien sollen auf die flächige Lasertransfektion erweitert werden, um ganze Gewebverbände wie Tumore in ihrer Immunogenität modifizieren zu können und damit die Ergebnisse von immuntherapeutischen Strategien (Vakzinierung) lokal zu verbessern. Das Expansionsverhalten und die immunostimulatorische Potenz der transfizierten DZ werden charakterisiert und weiterhin der Effekt der IMM in vivo im Gewebeverband untersucht. Der Einsatz der IMM-Vakzinierungsstrategien (DZ/in vivo Transfektion) soll im autologen und allogenen Großtiermodell sowie Kleintiermodell erfolgen. Das canine Großtiermodell ist ein Auszucht-Modell, welches bezüglich der genetischen Varianz dem menschlichen Immunsystem deutlich mehr ähnelt als Inzucht Tiermodelle. Untersuchungen im Bereich der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSZT) haben gezeigt, dass eine sehr gute Übertragbarkeit der am Hund erhaltenen Ergebnisse auf das humane System besteht.

Mitarbeiter:

Prof. Dr. I. Nolte, PD Dr. Murua Escobar, Dr. S. Willenbrock  

Kooperationspartner:
Klinik für Innere Medizin III - Hämatologie, Onkologie, Palliativmedizin, Universität Rostock, Prof. Dr. C. Junghanß
Institut für Quantenoptik, Leibniz Universität Hannover, Prof. Dr. A. Heisterkamp
Biomedizinische Optik, Biophotonische Bildgebung und Manipulation, Laser Zentrum Hannover, Dr. M. Schomaker

Laufzeit:

seit 2014, fortlaufend

 

Publikationen:

Sterenczak KA, Meier M, Glage S, et al: Longitudinal MRI contrast enhanced monitoring of early tumour development with manganese chloride (MnCl2) and superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIOs) in a CT1258 based in vivo model of prostate cancer. BMC Cancer 12:284, 2012.

Durán MC, Willenbrock S, Carlson R, Feige K, Nolte I, Murua Escobar H. Enhanced protocol for CD14+ cell enrichment from equine peripheral blood via anti human CD14 mAb and automated magnetic activated cell sorting. Equine Vet J. 2013 Mar;45(2):249-53. doi: 10.1111/j.2042-3306.2012.00616.x. Epub 2012 Sep 19.

Rütgen BC*, Willenbrock S*, Reimann-Berg N, Walter I, Fuchs-Baumgartinger A, Wagner S, Kovacic B, Essler SE, Schwendenwein I, Nolte I, Saalmüller A, Murua Escobar H: Authentication of primordial characteristics of the CLBL-1 cell line prove the integrity of a canine B-cell lymphoma in a murine in vivo model. PLoSOne 2012, 7(6). *equally contributed authorship

S. Willenbrock, S. Knippenberg, M. Meier, R. Hass, P. Wefstaedt, I. Nolte, H. Murua Escobar, S. Petri, In vivo MRI of Intraspinally Injected SPIO-labelled Human CD34+ Cells in a Transgenic ALS Mouse Model of ALS, In Vivo, 2012 Jan-Feb;26(1):31-8.

Sterenczak KA, Meier M, Glage S, Meyer M, Willenbrock S, Wefstaedt P, Dorsch M, Bullerdiek J, Murua Escobar H, Hedrich H, Nolte I: Longitudinal MRI contrast enhanced monitoring of early tumour development with manganese chloride (MnCl2) and superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIOs) in a CT1258 based in vivo model of prostate cancer. BMC cancer 2012, 12:284.

A.A. Ismail, S. Wagner, H. Murua Escobar, S. Willenbrock, K.A. Sterenczak, M.T. Samy, A.M. Abd El-Aal, I. Nolte, P. Wefstaedt, Effects of High Mobility Group A Protein Application on Canine Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells in vitro, Veterinary Medicine International, 2012;2012:752083. Epub 2012 Feb 8..

S. Willenbrock, O. Braun, J. Baumgart, S. Lange, C. Junghanss, A. Heisterkamp, I. Nolte, J. Bullerdiek, H. Murua Escobar, TNF-a stimulation triggers release of high mobility group box 1 (HMGB1) protein in mammary cells (MTH53A) of epithelial origin, Cytokine, 2012 Feb;57(2):210-20. Epub 2011 Dec 6..

K.A. Sterenczak, S. Kleinschmidt, P. Wefstaedt, N. Eberle, M. Hewicker-Trautwein, J. Bullerdiek, I. Nolte, H. Murua Escobar, Quantitative PCR and immunohistochemical analyses of HMGB1 and RAGE expression in canine disseminated histiocytic sarcoma (malignant histiocytosis), Anticancer Res, 31 (2011) 1541-1548.

N. Reimann-Berg, H. Murua Escobar, Y. Kiefer, R. Mischke, S. Willenbrock, N. Eberle, I. Nolte, J. Bullerdiek, Cytogenetic analysis of CpG-oligonucleotide DSP30 plus Interleukin-2-Stimulated canine B-Cell lymphoma cells reveals the loss of one X Chromosome as the sole abnormality, Cytogenet Genome Res, 135 (2011) 79-82.

D. Killian, A. Sekora, M. Schomaker, S. Willenbrock, A. Knuppel, H. Murua Escobar, A. Heisterkamp, I. Nolte, M. Freund, C. Junghanss, Enhanced secretion of high mobility group Box 1 (HMGB1) by haematopoietic stem cells after nucleofection and femtosecond laser-transfection, in:  Bone Marrow Transplantation, 2011, pp. S330-S330.

D. Heinemann, M. Schomaker, D. Motekaitis, J. Krawinkel, D. Killian, H. Murua Escobar, C. Junghanss, A. Heisterkamp, Gold nanoparticle mediated cell manipulation using fs and ps laser pulses for cell perforation and transfection, in:  Proceedings of the SPIE, 2011, pp. 7925-7918.

J. Fitting, D. Killian, C. Junghanss, S. Willenbrock, H. Murua Escobar, S. Lange, I. Nolte, S. Barth, M.K. Tur, Generation of recombinant antibody fragments that target canine dendritic cells by phage display technology, Vet Comp Oncol, 9 (2011) 183-195.

M.C. Duran, S. Willenbrock, A. Barchanski, J.M. Muller, A. Maiolini, J.T. Soller, S. Barcikowski, I. Nolte, K. Feige, H. Murua Escobar, Comparison of nanoparticle-mediated transfection methods for DNA expression plasmids - efficiency and cytotoxicity, Journal of Nanobiotechnology, 9 (2011) 47.

K.A. Sterenczak, A.E. Joetzke, S. Willenbrock, N. Eberle, S. Lange, C. Junghanss, I. Nolte, J. Bullerdiek, D. Simon, H. Murua Escobar. (2010) High-mobility group B1 (HMGB1) and receptor for advanced glycation end-products (RAGE) expression in canine lymphoma. Anticancer Res. 2010 Dec;30(12):5043-8.

M. Reichard, M. Hovakimyan, A. Wree, A. Meyer-Lindenberg, I. Nolte, C. Junghans, R. Guthoff, O. Stachs, Comparative in Vivo Confocal Microscopical Study of the Cornea Anatomy of Different Laboratory Animals, Curr Eye Res, 35 (2010) 1072-1080.

S. Petersen, J.T. Soller, S. Wagner, A. Richter, J. Bullerdiek, I Nolte, S. Barcikowski, H. Murua Escobar. (2009) Co-transfection of plasmid DNA and laser-generated gold nanoparticles does not disturb the bioactivity of GFP-HMGB1 fusion protein. J Nanobiotechnology. Oct 24;7:6.

K.A. Sterenczak, S. Willenbrock, M. Barann, M. Klemke, J.T. Soller, N. Eberle, I. Nolte, J. Bullerdiek, H. Murua Escobar. (2009) Cloning, characterization, and comparative quantitative expression analyses of Receptor for Advanced Glycation End products (RAGE) transcript forms. Gene. 434(1-2):35-42

J. Baumgart, W. Bintig, A. Ngezahayo, S. Willenbrock, H. Murua Escobar, W. Ertmer, H. Lubatschowski, A. Heisterkamp. (2008) Quantified femtosecond laser based opto-perforation of living GFSHR-17 and MTH53a cells, Optics Express, Vol. 16, No. 5, 3021-3031

S. Altmann, S. Lange, J. Pommerencke, H. Murua Escobar, J. Bullerdieck, I. Nolte, M. Freund, C. Junghanss. (2008) High Mobility Group Box 1-Protein expression in canine hematopoetic cells and influence on canine peripheral blood mononuclear cell proliferative activity, Veterinary Immunology and Immunopathology. 2008 15;126(3-4):367-72

M. Schomaker, D. Heinemann, D. Killian, S. Willenbrock, T. Ripken, C. Junghanss, I. Nolte, H. Meyer, H. Murua Escobar, A. Heisterkamp, “Establishment of a non-viral gold nanoparticle mediated laser transfection method for gene therapeutic approaches” Histology and Histopathology vol. 27, P-074, (2012)

M. Schomaker, D. Killian; S. Willenbrock, E. D. Diebold, E. D. Mazur, W. Bintig, A. Ngezahayo, I. Nolte, H. Murua Escobar, C. Junghanss, H. Lubatschowski, A. Heisterkamp. (2010) Ultrashort laser pulse cell manipulation using nano- and micro- materials, Optics and Photonics, San Diego, SPIE, Proceedings Vol 7762, P77623g

D. Killian, A. Knueppel, S. Willenbrock, H. Murua Escobar, A. Heisterkamp, H. Lubatschowski, A. Sekora, M. Freund, C. Junghanss. (2010) Influence of high mobility group Box 1 (HMGB1) on allogeneic immune responses. EBMT 2010 36th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation, 21.03.-24.03. 2010 Vienna, Austria. In:  Bone Marrow Transplantation 45 (Suppl. 2): P S278

S. Willenbrock, S. Lange, O. Braun, P. Wefstaedt, D. Simon, F. Battermann, N. Eberle, C. Junghanss, J. Bullerdiek, I. Nolte, H. Murua Escobar. (2008) Evaluation of the canine HMGB1 protein as a stimulating cytokine. Veterinary Cancer Society Annual Conference. 18. – 21. 10 2008, Seattle, USA. In: 2008 Proceedings of the Veterinary Cancer Society – Seattle: P 23

M. Schomaker, H. Fehlauer, W. Bintig, A. Ngezahayo, I. Nolte, H. Murua Escobar, H. Lubatschowski, A. Heisterkamp, Fs- laser cell perforation using gold nanoparticles of different shapes, Proceedings of the SPIE, Volume 7589, pp. 75890C-75890C-5 (2010)

 

 

Dissertation:

 

Willenbrock, S: Functional evaluation of HMGB1 as immune therapeutic effector molecule for cell-based vaccination strategies. Dissertation 2013, angefertigt an der Universität Bremen in Kooperation mit der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.

 

Evaluation von laserabladierten Nanopartikeln als MRT-Kontrastagenzien - Zelltoxizität und MRT-Imagingeigenschaften

Kommerzielle Eisenoxid-Nanopartikel werden zurzeit als Kontrastmittel im Bereich der bildgebenden Diagnostik über Magnetresonanztomographie (MRT) für diverse Anwendungen genutzt. Über die verwendeten klinisch zugelassenen Eisenoxid-Nanopartikel können sowohl Zellen als auch Gewebe kontrastverstärkt visualisiert werden. Prinzipiell bieten Nanopartikel die Möglichkeit, gezielt spezifische Binder oder Effektormoleküle (z.B. siRNAs) zu koppeln und so ein  gerichtetes Targeting von Zellen und Geweben zu ermöglichen. Somit besitzen gekoppelte Nanopartikelkonstrukte einen multiplen Charakter, der gleichzeitig ein gerichtetes Labelling, eine Modulierung von zellulären Prozessen als auch eine diagnostische Darstellung erlaubt.
In vorherigen in den Forschungslaboren der Klinik für Kleintiere durchgeführten Arbeiten wurde bereits an der Markierung und Visualisierung von Stammzellen, primären Zellen und Zelllinien mittels kommerzieller Eisenoxid-Nanopartikel gearbeitet. Diese Arbeiten wurden durchgeführt, um die Visualisierung von Zellen und Geweben über Eisenoxid-Nanopartikel vermittelte Kontrastverstärkung in vitro und in vivo mittels MRT zu verbessern und somit ein sensibleres Imaging von zelltherapeutischen und regenerativen Ansätzen zu erlauben.
In Erweiterung an die vorangegangenen Projekte werden nun neuartige am Laser Zentrum Hannover e.V. (LZH) generierte Nanopartikel (Eisen-, Gold-, Platin-Konjugate) und deren Effekte, wie beispielsweise deren Einfluss auf das Zellproliferationsverhalten nach definierten Zeitpunkten an verschiedenen Zelltypen charakterisiert und vergleichend zu kommerziellen Eisenoxid-Nanopartikeln evaluiert. Die Toxizität der Nanopartikelmarkierung auf die jeweiligen Zellen wird u. a. mittels Proliferationstests und Durchflusszytometrie bestimmt. Weiterhin werden definierte Nanopartikel-markierte Zellzahlen in Agar-Gewebephantome eingebettet und über Magnetresonanztomographie (MRT) bei Feldstärken von 3T bzw. 7T visualisiert, um minimal detektierbare Zellzahlen zu ermitteln.


Mitarbeiter:

Prof. Dr. I. Nolte, PD Dr. Murua Escobar, Dr. Saskia Willenbrock, Nicole Dörffer

Kooperationspartner:
Laser Zentrum Hannover e.V., Hannover, Gruppe Nanomaterialien, Dr. L. Saijti

Laufzeit:

seit 2011, fortlaufend

 

Publikationen:
Willenbrock S, Knippenberg S, Petri S, Nolte I, Murua Escobar H. Nanoparticle based labelling of canine cells for in vivo detection. In: Proceedings of the European Society of Veterinary Oncology 2011. European Society of Veterinary Oncology (ESVONC) Annual Congress 2011. 23.03.   27.03.2011, Glasgow, Scotland, UK.

Sterenczak KA, Meier M, Glage S, Meyer M, Willenbrock S, Wefstaedt P, Dorsch M, Bullerdiek J, Murua Escobar H, Hedrich H, Nolte I: Longitudinal MRI contrast enhanced monitoring of early tumour development with manganese chloride (MnCl2) and superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIOs) in a CT1258 based in vivo model of prostate cancer. BMC cancer 2012, 12:284.

Willenbrock S, Knippenberg S, Meier M, Hass R, Wefstaedt P, Nolte I, Murua Escobar H, Petri S: In vivo MRI of intraspinally injected SPIO-labelled human CD34+ cells in a transgenic mouse model of ALS. IN VIVO 2012a, 26(1):31 8.

Evaluation der Claudin-Gene des Hundes als funktionelle Targets zur Entwicklung nanopartikelvermittelter tumortherapeutischer Ansätze

In diesem Projekt werden anhand der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und der Luminex bead-conjugated Technology vergleichende Genexpressionanalysen an caninen Zelllinien und caninen Mamma-Gewebsproben (nicht-neoplastisch und neoplastisch) durchgeführt.

 

Die Claudin-Proteine sind ein struktureller Bestandteil der Tight Junctions in epithelialen Gewebe, welche in Zellverbänden nebeneinander liegende Zellen miteinander verbinden.

Aufgrund ihrer Struktur, welche unter anderem zwei extrazelluläre Schleifen enthält, und ihrer Lokalisation in der lateralen Zellmembran, regulieren die Claudine den parazellulären Fluss von Flüssigkeiten und halten so die Homöostase im Gewebe aufrecht.

Veränderungen der Claudin-Expression werden sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin mit verschiedenen pathologischen Prozessen wie der Tumor- und Metastasenentstwicklung assoziiert. Immunhistologische Untersuchungen an caninem Gewebe zeigen, dass die Claudin-Expression in neoplastischem Gewebe dereguliert ist.

 

Um die verschiedenen Zelllinien und Gewebeproben auf ihre Claudin -1, -3, -4 und  -7-Expressionmuster zu untersuchen, wurden in einem ersten Schritt spezifische Primer-Assays designt und nach erfolgreicher Verifizierung der generierten PCR Produkte durch konventionelle Sequenzierung wurde die Gen-Expression in caninen Zelllinien charakterisiert. Anschließend wurde mit der Charakterisierung der Claudin-Gen-Expression von nicht-neoplastischem caninen Mammagewebe und caninen Mammatumoren begonnen.

Des Weiteren wurden Western Blots an den Zelllinien durchgeführt, um das Ergebnis der Genexpression auf Proteinebene zu bestätigen.

 

Mithilfe der Luminex bead-conjugated Technology wurde ebenfalls die Genexpression in Zelllinien und Gewebeproben untersucht. Luminex bead-conjugated Technology bietet die Möglichkeit in einem Durchlauf mehrere Targets zu untersuchen. Dies bietet einerseits die Möglichkeit eine große Anzahl an Proben und gleichzeitig mehrere Gene zu messen, außerdem minimiert es Handling-Varianzen.

 

Mitarbeiter:

Prof. Dr. I. Nolte, PD Dr. H. Murua Escobar, Dr. S. Willenbrock, S. Hammer

 

Kooperationspartner:

Institut für Biophysik, Zellphysiologie und Zelluläre Mechanik, Leibniz Universität Hannover, Prof. Dr. A.Ngezahayo

Institut für Angewandte Optik, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Prof. Dr. A. Heisterkamp

Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein

 

Laufzeit:

fortlaufend seit 2012

 

Publikationen:

Hammer SC, Ngezahayo A, Murua Escobar H, Nolte I: Evaluation der Claudin

 

Hammer SC, Nagel S, Maibaum D, Pfeiffer K, Ngezahayo A, Nolte I, Murua Escobar H: Evaluation of the canine claudin2. Light and DNA-Tagung 2013, Jena, Deutschland, Vortrag

 

Hammer SC, Nagel S, Maibaum D, Pfeiffer K, Ngezahayo A, Nolte I, Murua Escobar H: Claudin

 

Hammer SC, Nagel S, Maibaum D, Pfeiffer K, Ngezahayo A, Nolte I, Murua Escobar H: Claudin22. Jahrestagung der Fachgruppe "Innere Medizin und Klinische Labordiagnostik" der DVG 2014, Giessen, Deutschland, Vortrag

 

Hammer S, Nagel S, Alnajjar S, Heisterkamp A, Hewicker-Trautwein M, Ngezahayo A, Nolte I, Murua Escobar H: Establishment of a molecular screening system for claudinESVONC Annual Congress 2014, Wien, Österreich, Posterbeitrag

 

Hammer S, Nagel S, Alnajjar S, Heisterkamp A, Hewicker-Trautwein M, Ngezahayo A, Nolte I, Murua Escobar H: Claudin

 

Hammer S, Alnajjar S, Nagel S, Heisterkamp A, Hewicker-Trautwein M, Ngezahayo A, Nolte I, Murua Escobar H: Characterisation of Claudin

 

Hammer S, Alnajjar S, Nagel S, Ngezahayo A, Heisterkamp A, Hewicker-Trautwein M, Nolte I, Murua Escobar H: Charakterisierung der Claudin-Genexpression caniner Mammagewebe. 2. Jahrestagung der Fachgruppe "Innere Medizin und Klinische Labordiagnostik" der DVG 2015, Leipzig, Deutschland, Vortrag

Hammer S, Alnajjar S, Nagel S, Heisterkamp A, Willenbrock S, Hewicker-Trautwein M, Ngezahayo A, Nolte I, Murua Escobar H: Comparison of branched DNA signal amplification combined with multi-analyte profiling bead technology and quantitative real-time PCR for analyses of Claudin-gene-expression in canine mammary samples. ESVONC Annual Congress 2015, Krakau, Polen, Posterbeitrag

Vergleichende Evaluation von Arylindolylmaleimid-Derivaten und konventionellen Chemotherapeutika auf Tumorzelllinien

Im Rahmen dieses Projektes wurden bereits zwei Derivate eines neuen Arylindolylmaleimids als potentielle Chemotherapeutika getestet. Dies basierte auf vorangegangenen Studien in der AG Junghanß (Hämatologie, Onkologie und Palliativmedizin) der Universität Rostock, von der beide Substanzen (PDA-66 und PDA-377) zur Verfügung gestellt werden.
In den dortigen Untersuchungen wurden die Substanzen zu Forschungszwecken bereits eingesetzt und an verschiedenen Zelllinien evaluiert. Das Arylindolylmaleimid soll als potentieller GSK3β-Inhibitor proliferationshemmend auf Tumorzellen wirken und birgt daher möglicherweise Optionen einer gezielten Therapie durch die Inhibition deregulierter Signalwege.
Ziel des Projektes ist die vergleichende Untersuchung der Auswirkungen dieser potenziellen Chemotherapeutika auf weitere canine als auch humane Tumorzelllinien.
Dieser Fragestellung wurde bereits mit verschiedenen Methoden nachgegangen: Einerseits wurden die morphologischen Veränderungen der mit den zwei PDA Derivaten behandelten Zellen mikroskopisch mit Hilfe des Life Cell Imagings beobachtet und erfasst, andererseits wurden Proliferationstests (BrdU- und WST-1–Assays) durchgeführt, um Veränderungen in der metabolischen Aktivität feststellen zu können. 

 

In einer weiterführenden Studie soll nun das wirksamere der beiden Chemotherapeutika (PDA-66) verwendet werden, um Gene bzw. SNPs (engl. Single Nucleotide Polymorphism; Einzelnukleotid-Polymorphismus) zu identifizieren, welche die Resistenz der Tumorzelllinien gegenüber dem verwendeten Chemotherapeutikum verstärken. Bereits vorhandene oder während einer Therapie gewonnene Resistenzen gegenüber dem verwendeten Therapeutikum stellen nach wie vor ein großes Problem in der effektiven Behandlung von Tumoren dar.

Daher sollen in vitro verschiedene humane und canine Prostatakarzinom-abgeleiteten Zelllinien mit geringen Konzentrationen von PDA-66 behandelt werden, wodurch der relative Anteil an widerstandsfähigeren Tumorzellklonen erhöht werden kann. Mittels Next Generation Sequencing soll die isolierte RNA für Genexpressionsanalysen und die DNA zur Identifizierung möglicher Punktmutationen/SNPs untersucht werden, um Unterschiede gegenüber einer unbehandelten Kontrolle zu ermitteln. Entsprechend der gewonnenen Daten sollen Gene bzw. SNPs (entsprechend dem höheren Anteil an widerstandsfähigeren Zellen nach PDA-66-Behandlung) identifiziert werden, welche potentiell die Resistenz der Zellen gegenüber dem Chemotherapeutikum verstärken. Die Daten sollen mit einem etablierten Chemotherapeutikum (wie z.B. Doxorubicin) verglichen werden.

 

Mitarbeiter:

Prof. Dr. I. Nolte, PD Dr. H. Murua Escobar, D. Jilani, L. Schmidt, J. T. Schille  

Kooperationspartner:
Klinik für Innere Medizin III - Hämatologie, Onkologie, Palliativmedizin, Universität Rostock, Prof. Dr. C. Junghanß

Laufzeit:

seit 2014, fortlaufend

Publikationen:
Kretzschmar C, Roolf C, Langhammer TS, Sekora A, Pews-Davtyan A, Beller M, Frech MJ, Eisenlöffel C, Rolfs A, Junghanss C. The novel arylindolylmaleimide PDA-66 displays pronounced antiproliferative effects in acute lymphoblastic leukemia cells (2014). BMC Cancer. 14:71. doi: 10.1186/1471-2407-14-71

 

Masterarbeiten:

Laura Christin Schmidt: Application of PDA-66 and its derivate PDA-377 on lymphoma cell lines - Characterization of the induced effects -, Masterarbeit 2014, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

 

Daria Jilani: Characterization of PDA-66 and PDA-377 mediated effects on human and canine prostate carcinoma cell lines, Masterarbeit 2014, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

 

Identifikation und Charakterisierung von Tumorstammzellen

Canine cancer is lately been considered to be of significant value for cancer research due to the fact that these neoplasias arise spontaneously providing a naturally occurring model for the respective human counterparts. The presentation of the canine neoplasias is characterised by a similar biologic behaviour showing comparable metastasising patterns to the lymph nodes and or the skeletal system. In terms of molecular markers canine neoplasias show the same marker expression patterns as their human counterparts. Thus, therapeutic approaches established and validated in dogs provide considerable potential for the development of cancer treatment strategies in men. The herein presented project aims at the development of a “theragnostic approach” combining diagnostic procedures with therapeutic measures. To achieve this, a detailed characterisation of the mechanisms involved in canine cancer is required. Cancer stem cells (CSC) are considered to play a major role in cancer development, thus a detailed cellular and molecular characterisation could be of significant value for the development of therapeutic approaches targeting canine cancer.

Identifikation und Charakterisierung von Tumorstammzellen in caninen Lymphomen


The purpose of this study is identification and characterization of “stem-cell like cells” in canine lymphoma cell lines CLBL-1 and CLBL-1M. In the first step the expression patterns of stem cell marker genes (CD44, c-Kit, CD133, CD 34, MELK, ITGA6, OCT4, DDX5, c-MYC, Nanog, Klf4 and SOX2) will be analyzed in the canine B-cell lymphoma cell line CLBL1 and the derived daughter cell line CLBL1-1M. Further, the population of stem cell like cells will be enriched in the cell lines by cultivating the cells in conditions allowing the generation of stem cell spheres. If successful, these spheres will be isolated and cultivated separately and screened for the mentioned gene and protein markers. Finally, the candidate genes serving as potential cancer stem cell markers will be identified and valuated in vitro and in vivo.

Mitarbeiter:

Prof. Dr. I. Nolte, PD Dr. Murua Escobar, W. Liu, Dr. S. Willenbrock

Kooperationspartner:
Department für Pathobiologie, Veterinärmedizinische Universität Wien, Dr. B. Rütgen
Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein

Laufzeit:

seit 2011, fortlaufend

 

Publikationen:
Willenbrock S, Rütgen BC, Reimann-Berg N, Wagner S, Kovacic B, Essler SE, Schwendenwein I, Nolte I, Saalmüller A, Murua Escobar H. Chromosomal stability and proliferative response of a canine B cell lymphoma cell line after inoculation in a murine in vivo model. In: Proceedings of the Veterinary Cancer Society 2012, p. 94. Veterinary Cancer Society Annual Conference. 18.10. - 21.10. 2012, Las Vegas, Nevada, USA.


Identifikation und Charakterisierung von Tumorstammzellen in caninen Prostatatumoren


In human prostate cancer cells with a stem cell-like character (cancer stem cells) are considered to play a major role in disease development, progression and relapse. Aim of the study was to evaluate if similar cells are present and active in canine prostate cancer providing a naturally-occurring mammalian model for the development of therapeutic approaches targeting CSC. First, stem cell marker expression of CD133, CD44, c-KIT, CD34, ITGA6, OCT4, DDX5 and MELK in canine prostate carcinomas and prostate cyst cell lines were screened by Polymerase Chain Reaction (PCR), quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) and partially analyzed by flow cytometry. Then the canine prostate adenocarcinoma cell line CT1258 was cultivated in suspension using serum-free medium in order to generate spheroid cell clusters. CSC markers genes CD44, CD133, c-KIT, CD34, ITGA6, c-MYC, NANOG, DDX5, KLF4, SOX2, MELK and OCT4 were analyzed in suspension cells and valuated the possibility to be cancer stem cell markers for canine prostate cancer.

Mitarbeiter:

Prof. Dr. I. Nolte, PD Dr. Murua Escobar, M. Moulay, Dr. S. Willenbrock

Kooperationspartner:
Institut für Biophysik, Zellphysiologie & Zelluläre Mechanik, Leibniz Universität Hannover, Prof. Dr. A. Ngezahayo
Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein

Laufzeit:

seit 2010, fortlaufend

Publikationen:

 

Liu W, Selçuk F, Rütgen BC, Moulay M, Willenbrock S, Hammer SE, Sterenczak KA, Junghanss C, Hewicker-Trautwein M, Nolte I, Murua Escobar H. Evaluation of Stem Cell Marker Expression in Canine B-Cell Lymphoma Cell Lines, B-Cell Lymphoma-generated Spheres and Primary Samples. Anticancer Res. 2015 May;35(5):2805-16. PMID: 25964560  

 

Liu W, Moulay M, Willenbrock S, Roolf C, Junghanss C, Ngenazahayo A, Nolte I, Murua Escobar H. Comparative characterization of stem cell marker expression, metabolic activity and resistance to doxorubicin in adherent and spheroid cells derived from the canine prostate adenocarcinoma cell line CT1258. Anticancer Res. 2015 Apr;35(4):1917-27. PMID: 25862843

 

 

 

Liu W, Ruetgen BC, Selcuk F, Willenbrock S, Essler S, Nolte I, Murua Escobar H. Characterization of stem cell markers in canine B-cell lymphoma, ESVONC Wien 2014, Vortrag    

 

Moulay M, Liu W, Willenbrock S, Sterenczak KA, Carlson R, Ngezahayo A, Murua Escobar H, Nolte I. Evaluation of stem cell marker gene expression in canine prostate carcinoma- and prostate cyst-derived cell lines.  Anticancer Res. 2013 Dec;33(12):5421-31.PMID: 24324078

 

Murua Escobar H, Moulay M, Rütgen BC, Willenbrock S, Essler S, Nolte I. Characterization of stem cell marker expression in canine neoplasias. VCS Minneapolis 2013, Vortrag      

 

 

Dissertation  

 

Moulay, MA: Expression of stem cell marker genes in canine prostate cancer cell lines as basis for the development of molecular therapeutic tools, Dissertation 2014, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

 

 

Charakterisierung des Zytokinexpressionsmusters bei Hunden mit malignem Lymphom und Einfluss auf das Ansprechverhalten bei Zytostatikatherapie

Das maligne Lymphom ist eine der häufigsten Tumorerkrankungen des Hundes. Das canine Lymphom weist eine Reihe von Gemeinsamkeiten mit dem Non-Hodgkin-Lymphom (NHL) des Menschen auf, welche sich über das biologische Verhalten und die Präsentation der dieser Neoplasien erstrecken. Diese tumorcharakteristischen Ähnlichkeiten legen nahe, dass die molekularen und zellulären tumorassoziierten Entstehungsmechanismen ebenfalls ähnlich sind. Das spontane Auftreten und die biologischen Ähnlichkeiten dieser Neoplasien als auch die vergleichbaren Lebensumständen beider Spezies führen dazu, dass dem Hund eine wichtige Rolle als Modellorganismus für das NHL des Menschen zugeschrieben wird.
Die Therapie der Wahl zur Behandlung von Hunden mit malignem Lymphom ist die chemotherapeutische Kombinationschemotherapie mit Vincristin, Cyclophosphamid, Doxorubicin und Prednislon. Die  medianen Remissionszeiten liegen bei multizentrischen Lymphomen bei 10 bis 12 Monaten und die medianen Überlebenszeiten zwischen 12 und 17 Monaten. Verschiedene Faktoren wie Stadium, Substadium, Immunophenotyp der Neoplasien weisen eine direkte Korrelation mit der Prognose des Krankheitsverlaufes auf.
In diesem Zusammenhang ist die Charakterisierung von molekularen oder zellulären Biomarker wie Zytokinen oder Oberflächenproteine für diagnostische und prognostische Zwecke sowohl für die veterinärmedizinische als auch für die vergleichende onkologische Forschung von großem Interesse.
Es wird davon ausgegangen, dass es sich beim NHL um eine Störung des Immunsystems handelt, bei der die Tumorzellen selber Zytokine bilden, als auch umgekehrt von Zytokinen in verschiedenster Weise beeinflusst werden. Somit richtet sich der Fokus der Forschung zunehmend auf die vielfältigen Einflüsse der Zytokine, die in einigen Therapieprotokollen bereits zur Behandlung des NHL eingesetzt werden.
Im Vergleich zu den Verhältnissen in der Humanmedizin gibt es für den Hund bislang nur wenige evaluierte molekulare und zelluläre prognostische und diagnostische Marker. Es ist jedoch davon auszugehen, dass die Anzahl der verfügbaren evaluierten Markermoleküle mit steigender Studienanzahl, die sich mit der Charakterisierung und Evaluierung solcher Marker im veterinärmedizinisch onkologischen Bereich beschäftigen, zunimmt. Wünschenswert wäre für zukünftige Analysen dabei vor allem die Möglichkeit, mehrere Parameter gleichzeitig in einem Ansatz zu untersuchen, um damit die Effizienz der Analyse zu optimieren.

Das Ziel dieser Studie ist die Untersuchung der Proteinexpression verschiedener Zytokine beim malignen Lymphom des Hundes nach Zytostatikatherapie mittels der Luminex xMAP Technologie. Die Luminex xMAP-Technology vereinigt die Prinzipien der Durchflusszytometrie und der Bead-basierten Zytometrie miteinander und erlaubt aufgrund des spezifischen Fluoreszenzfarbtons der separat detektierbaren Beads, eine Vielzahl an Analyten parallel zu untersuchen.
Mittels dieses Messverfahrens soll der Zytokinspiegel an verschiedenen Zeitpunkten geprüft werden. Diese Messergebnisse erlauben dann eine Aussage darüber zu treffen, in welcher Höhe die Expression der entsprechenden Zytokine von den neoplastisch veränderten Lymphozyten hochreguliert wird und ob ein Einfluss der Zytokinexpression auf die Prognose feststellbar ist.

 


Mitarbeiter:

Prof. Dr. I. Nolte, PD Dr. Murua Escobar, PD Dr. D. Betz, Dr. N. Eberle, Dr. S. Willenbrock

Laufzeit:

seit 2012, fortlaufend

Publikationen:
Meyer A, Eberle N, Bullerdiek J, Nolte I, Simon D (2010) High-mobility group B1 proteins in canine lymphoma: prognostic value of initial and sequential serum levels in treatment outcome following combination chemotherapy. Vet Comp Oncol 8: 127-137

Winkler S, Murua Escobar H, Reimann-Berg N, Bullerdiek J, Nolte I (2005b) Cytogenetic investigations in four canine lymphomas. Anticancer Res 25: 3995-3998

Reimann-Berg N, Murua Escobar H, Kiefer Y, Mischke R, Willenbrock S, Eberle N, Nolte I, Bullerdiek J (2011a) Cytogenetic analysis of CpG-oligonucleotide DSP30 plus Interleukin-2-Stimulated canine B-Cell lymphoma cells reveals the loss of one X Chromosome as the sole abnormality. Cytogenet Genome Res 135: 79-82

Durán MC, Willenbrock S, Müller JMV, Nolte I, Feige K, Murua Escobar H: Establishment and evaluation of a bead-based Luminex assay allowing simultaneous quantification of equine IL-12 and IFN-alpha (2013). Anticancer Res Apr;33(4):1325-36.

Funktionelle Proteintransfektion als immuntherapeutischer Ansatz zur Tumorvakzinierung mittels GNOME-Lasertransfektion

Die Beladung von Zellen mit verschiedenen Molekülen für therapeutische Ansätze ist ein wichtiger Bereich der Molekularmedizin. Hierbei bieten besonders Primär- und Stammzellen großes Potential zur Entwicklung therapeutischer Ansätze. Konventionelle Methoden stoßen dabei jedoch besonders bei sensitiven und schwer zu manipulierenden Zellen oftmals an die Grenzen des Möglichen. Daher sind alternative Methoden zur Beladung von Zellen mit verschiedenen Moleküle für therapeutische und diagnostische Zwecke laufend im Fokus der Molekularmedizin, um Zellen für therapeutische Ansätze in einer ausreichenden Zellzahl zu manipulieren.
Mit der am Laser Zentrum Hannover, AG Biophotonische Bildgebung und Manipulation, entwickelte neuartigen Methode der Goldnanopartikelvermittelten (gold nanoparticle mediated; GNOME) Lasertransfektion ist es möglich, diverse bioaktive Moleküle wie z.B. genetisches Material oder Proteine ins Zellinnere zu schleusen. Diese neuartige Methode nutzt für eine transiente Membranpermeabilisierung Plasmonenresonanzen, die durch Laserbestrahlung auf Gold-Nanopartikeln hervorgerufen werden. Durch die Membranpermeabilisierung erfolgt dann direkt die molekulare Beladung von Zellen. Da es sich bei der GNOME-Lasertransfektion um einen physikalischen Prozess handelt und es somit keine aktive Beteiligung der Zelle gibt, ist diese Methode im Gegensatz zu anderen konventionellen Methoden weitestgehend unabhängig vom bearbeiteten Zelltyp. Mit dieser Methode ist es möglich einen hohen Durchsatz mit gleichzeitig einhergehender zellschonender Behandlung zu erreichen und somit genügend Zellen für therapeutische Ansätze in adäquater Zeit zu manipulieren.
In dem vorliegenden Projekt sollen Zellen mit rekombinanten Proteinen wie u.a. dem Mobility Group Box 1 (HMGB1) beladen werden. Hintergrund ist ein therapeutischer Ansatz welcher auf die Vakzinierung mit modifizierten Immunzellen zur Behandlung von Leukämie zielt. Durch die angestrebte Beladung von Zellen mit rekombinantem HMGB1 soll eine gesteigerte Immunreaktion nach der Vakzinierung erreicht werden. Das HMGB1 Protein hat extrazellulär eine proinflammatorische (entzündungsfördernde) Wirkung und soll nach einer Stimulation der manipulierten Zellen lokal immunstimulatorisch auf andere Zellen wirken, welche wiederum aktiv an der Eliminierung von Tumorzellen beteiligt sind.
Zur Überprüfung der Machbarkeit werden Zellen in vitro mittels GNOME-Lasertransfektion mit rekombinantem HMGB1 Protein beladen. Im ersten Schritt der Studie werden Proteine in verschiedenen Konzentrationen in verschiedene eukaryontische Zelllinien eingebracht um eine „therapeutische Dosis“ zu evaluieren. Im Folgenden wird eine erfolgreiche Stimulation mit ausgewählten Zytokinen und damit die gesteuerte Abgabe des künstlich eingebrachten rekombinanten HMGB1 in das extrazelluläre Medium angestrebt. Hierfür werden verschiedene Analysemethoden wie Flow Zytometrie, Western Blot und PCR eingesetzt. Ebenfalls können in den ex vivo Versuchen grundlegende  Fragestellungen zu den Auswirkungen des HMGB1 Proteins auf Zellen sowie die Stimulation geklärt werden. Fernziel des Projektes ist es, die manipulierten Zellen als Tumorvakzine einzusetzen.

Mitarbeiter:

Prof. Dr. I. Nolte, PD Dr. Murua Escobar, Dr. S. Willenbrock

Kooperationspartner:
Biomedizinische Optik, Biophotonische Bildgebung und Manipulation, Laser Zentrum Hannover e.V., Dr. T. Ripken, Dr. H. Meyer, Dr. M. Schomaker
Klinik für Innere Medizin III - Hämatologie, Onkologie, Palliativmedizin, Universität Rostock, Prof. Dr. C. Junghanß

Laufzeit:

seit 2013, fortlaufend

Publikationen:
Heinemann D, Schomaker M, Kalies S, Schieck M, Carlson R, Murua Escobar H, Ripken T, Meyer H, Heisterkamp A. Gold nanoparticle mediated laser transfection for efficient siRNA mediated gene knock down. PLoS One. 2013;8(3):e58604. doi: 10.1371/journal.pone.0058604. Epub 2013 Mar 11. PMID: 23536802

 

 

Heinemann D, Kalies S, Schomaker M, Ertmer W, Murua Escobar H, Meyer H, Ripken T. Delivery of proteins to mammalian cells via gold nanoparticle mediated laser transfection. Journal of Nanotechnology. 2014 Jun 20;25(24):245101. doi: 10.1088/0957-4484/25/24/245101. Epub 2014 May 23. PMID: 24859743  

 

Schomaker M, Heinemann D, Kalies S, Willenbrock S, Wagner S, Nolte I, Ripken T, Murua Escobar H, Meyer H, Heisterkamp A. Characterization of nanoparticle mediated laser transfection by femtosecond laser pulses for applications in molecular medicine. Journal of Nanobiotechnology. 2015 Feb 3;13(1):10. doi: 10.1186/s12951-014-0057-1. PMID: 25645721  

 

Schomaker M, Killian D, Willenbrock S, Heinemann D, Kalies S, Ngezahayo A, Nolte I, Ripken T, Junghanß C, Meyer H, Escobar HM, Heisterkamp A. Biophysical effects in off-resonant gold nanoparticle mediated (GNOME) laser transfection of cell lines, primary- and stem cells using fs laser pulses. Journal of Biophotonics. 2014 Oct 9;9999(9999). doi: 10.1002/jbio.201400065. PMID: 25302483 [Epub ahead of print]

 

Prostataerkrankungen des Hundes

Etablierung gentherapeutischer Ansätze zur Behandlung caniner Prostatakarzinome

 

Karzinome der Prostata sind heterogene Tumorerkrankungen, die sowohl beim Menschen als auch beim Hund spontan auftreten. Obwohl sie mit einer Prävalenz von 0,2 - 0,6 % beim Hund relativ selten sind, liegt ihre Bedeutung in ihrer Aggressivität und den aktuell unzureichenden Therapieoptionen.
Eine frühzeitige Diagnose mit molekularen Markern, wie z.B. FolH1 (PSMA) oder PSA beim Menschen wären von großem Wert für den Behandlungserfolg beim Hund. Weiterhin würde ein tiefergehendes Verständnis der onkogenetischen Zusammenhänge die Entwicklung sowohl prognostischer, diagnostischer und vor allem therapeutischer Ansätze ermöglichen.
Die beim Hund natürlich vorkommenden Tumoren weisen mehrere Ähnlichkeiten zu den humanen androgen-unabhängigen Prostatakarzinomen auf. Im fortgeschrittenen Stadium treten in beiden Spezies gehäuft Metastasen in Lunge, Knochen und Lymphknoten auf.
Aufgrund dessen, dass der Hund eines der medizinisch am besten betreuten Haustiere ist, ähnlichen Umwelteinflüssen wie der Mensch ausgesetzt ist und einen ähnlichen Metabolismus besitzt, ist er ein sehr gutes Modell. Im Umkehrschluss bedeutet es aber auch, dass der Hund als erste Spezies von den in der Humanmedizin gewonnen Erkenntnissen profitieren wird.
In diesem Zusammenhang werden canine Gene charakterisiert und Assays evaluiert, die die nachfolgenden Arbeiten erst ermöglichen. Weiterhin werden in diesem Projekt vergleichende Genexpressionsanalysen zwischen Mensch und Hund sowie zwischen gesundem und entartetem Gewebe durchgeführt.
Ziel des Projektes ist die Etablierung therapeutischer Ansätze. Hierzu werden unterschiedliche Strategien verfolgt, wie der gentherapeutische Einsatz von Adeno-assoziierten Viren, in die verschiedene Antisense- oder miRNA-Konstrukte verpackt werden, welche die Expression von Onkogenen supprimieren sollen.
Zu den im Projekt angewandten Techniken zählen die in vitro Kultivierung caniner Zellen, welche für Vorabexperimente genutzt werden, sowie die quantitative real-time PCR und andere PCR-Techniken. Zusätzlich werden Proteinanalysen mittels Western Blot und Immunhistochemie durchgeführt, sowie der Einfluss bestimmter Gene auf die Zellteilung  mittels Proliferationsassays analysiert.
In naher Zukunft sollen die gewonnen Erkenntnisse die Entwicklung neuartiger Therapiekonzepte zur Behandlung von Prostatakarzinomen, sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin, ermöglichen.

Mitarbeiter:

Prof. Dr. I. Nolte, PD Dr. Murua Escobar, S. Wagner, Dr. S. Willenbrock

Laufzeit:

seit 2008, fortlaufend

 

Publikationen:
Wagner S, Willenbrock S, Nolte I, Murua Escobar H (2013) Comparison of non-coding RNAs in human and canine cancer. Frontiers in genetics 4: 46.

Willenbrock S, Reimann-Berg N, Eberle N, Bullerdiek J, Nolte I, Murua Escobar H. Establishment of a new canine prostate carcinoma cell line with complex karyotype changes involving polysomy 13. In: Proceedings of the 2nd WVCC 2012, p. 44. 2nd World Veterinary Cancer Congress (WVCC). 01.03. – 03.03.2012, Paris, France.

 

Wagner S, Maibaum D, Pich A, Nolte I, Murua Escobar H. Verification of a canine PSMA (FolH1) antibody. Anticancer Res. 2015 Jan;35(1):145-8. PMID: 25550545

 

 Wagner S, Murua Escobar H, Nolte I. Comparative gene expression analyses in canine prostate cancer. Veterinary Cancer Society annual conference 2013, Minneapolis, Vortrag    

Wagner S, Soller JT, Sterenczak K, Willenbrock S, Nolte I, Bullerdiek J, Murua Escobar H. Construction of let-7 miRNA expression-vectors for directed HMGA2 knock down. 18. Jahrestagung der FG „Innere Medizin und klinische Labordiagnostik“ der DVG (InnLab) 2010, Vortrag

 

Wagner S, Murua Escobar H, Nolte I. Vergleichende Genexpressionsanalysen an kaninen Prostataproben. 22. Jahrestagung der FG „Innere Medizin und klinische Labordiagnostik“ der DVG (InnLab) 2014, Gießen, Poster

 

Wagner S, Willenbrock S, Sterenczak K, Bullerdiek J, Nolte I, Murua Escobar H. Construction of let-7a expressing vectors for down regulation of the tumour marker HMGA2. European Society of Veterinary Oncology (ESVONC) Annual Congress 2011, Glasgow, Vortrag

 

Dissertation:

Wagner, S: Functional analyses of miRNAs and their targets in tumorigenesis, Dissertation 2014, angefertigt an der Leibniz Universität Hannover in Kooperation mit der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.

 

 

Erarbeitung einer differenzierten klinischen und molekularbiologische Prostatadiagnostik beim Hund  

 

Der Hund kann im Laufe seines Lebens eine Vielzahl an pathologischen Veränderungen der Prostata entwickeln. Zu diesen Erkrankungen gehören sowohl die akute als auch chronische Prostatitis, Prostataabszesse, benigne Prostatahyperplasie und maligne Prostatatumoren. Die klassischen Symptome bei Prostataerkrankungen sind oftmals Harn- oder Kotabsatzstörungen, die oft zu einem herabgesetzten Allgemeinbefinden führen. Je nach Schweregrad der Erkrankung können massive Einschränkungen für das Tier entstehen.  

Für die Behandlung von Prostatazysten, Prostatitis, Prostataabszess und benigner Prostatahyperplasien stehen verschiedene Therapieoptionen zur Verfügung, wohingegen das hochmaligne Prostatakarzinom des Hundes oftmals erst im Endstadium diagnostiziert wird.  

An der Klinik für Kleintiere wird eine klinische Studie mit der Zielsetzung einer klinischen, zytologischen und molekularbiologischen Charakterisierung der verschiedenen Prostataerkrankungen des Hundes durchgeführt.

Bisher stützt sich die klinische Verdachtsdiagnose beim Hund weitestgehend auf Befunde aus der klinischen Allgemein-, Röntgen- sowie Ultraschalluntersuchung. Eine sichere Diagnose ist nur mittels einer größeren Gewebeprobe durch eine histopathologische Untersuchung möglich, die im Rahmen einer aufwendigen Operation oder erst nach Eintritt des Todes gewonnen werden kann.  

Die Studie hat daher das Ziel, die bisherige Prostatadiagnostik des Hundes zu erweitern und mit so wenig belastenden Methoden und so wenig Gewebematerial wie nötig, so viele Informationen wie möglich zu erhalten. Weiterhin soll untersucht werden, ob mittels der erhobenen Befunde und Daten eventuelle Risikofaktoren, Vorstufen oder diagnostische Marker identifiziert werden können, die zukünftig einen Beitrag zur Früherkennung des Prostatakarzinoms leisten könnten.  

Für die Studie werden sowohl prostatagesunde, als auch prostataauffällige Rüden untersucht. Der Ablauf umfasst ein ausführliches Anamnesegespräch, sowie eine klinische Allgemeinuntersuchung mit einer rektalen Palpation der Prostata. Es schließt sich eine Blutentnahme und eine latero-laterale Röntgenaufnahme des kaudalen Abdomens an. Weiter wird ein Ultraschall des Abdomens durchgeführt mit einer abschließenden ultraschallgeführten Zystozentese und Feinnadelaspirationsbiopsie (FNA) des Prostatagewebes. Die mittels FNA gewonnenen Zellen werden zytologisch beurteilt und im weiteren Verlauf mittels Next Generation Sequencing molekularbiologisch untersucht. Das Next Generation Sequencing, eine Sequenziertechnik, bei der in einem hohen Maß parallel sequenziert werden kann, sodass die Ermittlung der Expression von einer Vielzahl von Genen in kurzer Zeit möglich ist.  

Die gewonnen Erkenntnisse sollen zur klinischen und genetischen Charakterisierung der unterschiedlichen Prostataerkrankungen und zur Früherkennung des Prostatakarzinoms beitragen.

 

Mitarbeiter:

Prof. Dr. I. Nolte, Prof. Dr. R. Mischke, PD Dr. Murua Escobar, Dr. Stephan Hungerbühler, Dr. S. Willenbrock, K. Lucas, H. Thiemeyer

 

Laufzeit:

seit 2014, fortlaufend

 

Kooperationspartner:

Tierärztliches Institut der Georg-August-Universität Göttingen, Prof. Dr. B. Brenig

Chronix biomedical, Prof. Dr. E. Schütz, Dr. J. Beck

 

 

 

 

Mammatumoren des Hundes

Bedeutung von Hormonrezeptoren bei Mammatumoren verschiedener Hunderassen in Abhängigkeit vom Kastrationsstatus

 

Tumoren des Gesäuges sind die häufigste beim weiblichen Hund gefundene Neoplasie. Dabei sind etwa 50% der Umfangsvermehrungen bösartig.

Viele Studien konzentrieren sich sowohl im humanen, als auch im veterinärmedizinischen Bereich auf die Erforschung der genomischen Ursachen für die Entstehung von Brustkrebs bei der Frau oder Mammatumoren beim Hund. Dabei werden in der Humanmedizin Östrogen- und Progesteronrezeptoren bereits eine prognostische, sowie prädiktive Bedeutung zugesprochen.

Das Ziel des vorliegenden Projektes ist es bei Mammatumoren des Hundes eine Expressionsanalyse der Rezeptoren von Östrogen, Progesteron, Prolaktin und Somatotropin durchzuführen.  Dabei soll das Auftreten der Rezeptoren bei benignen und malignen Gesäugetumoren im Vergleich zu gesundem Mammagewebe betrachtet werden. Die Untersuchung von ausgesuchten Hunderassen und von kastrierten und intakten Hündinnen soll Auskunft geben, ob rassespezifische oder kastrationsabhängige Veränderungen zu erkennen sind.

Nach vorheriger RNA-Isolierung wird die Expressionsanalyse der Mammagewebeproben anschließend mittels Luminex xMAP-Technologie unter Verwendung des QuantiGene® 2.0 Plex Assays erfolgen. Eine Multiplex-Reaktion ermöglicht es die mRNA der Hormonrezeptoren parallel in einer Probe zu detektieren.

 

Mitarbeiter: Prof. Dr. I. Nolte, PD Dr. H. Murua Escobar, Dr. S. Willenbrock, A. Mohr

Kooperationspartner: Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein

 

Laufzeit: seit 2014, fortlaufend    

 

 

 

Analysis of gene expression in different canine mammary tumor entities

 

The aim of this project is to assess gene expression in different canine mammary tumor entities. The outcome herein may lead to new prognostic/diagnostic tools benefiting dogs as well as their human counterpart.

A total number of 15 targets are analyzed and the samples utilized are obtained from three different sources: fresh frozen tissue, formalin fixed paraffin embedded (FFPE) blocks and cell culture. The RNA is isolated out of these samples using commercial available kits.

On the two first sources of material, the intention is to analyze the gene expression itself meanwhile in the cell culture the aim is to assess the expression of the referred targets over the time as the cultures develop.

FFPE tissues represent a unique source of archived biological material being at the same time challenging depending on the age of the samples, time of fixation and conditions of storage which directly reflect on the quality and integrity of the RNA. Therefore, it is also interesting to compare the different outcomes from fresh frozen tissue and FFPE samples when it comes to the reliability of the different sources.

The specimen are finally analysed using the Luminex technology which is bead-based relying on fluorescent antibody-coupled beads detecting soluble analytes in various biological samples. Each bead set is coated with a reagent specific to a particular target in order to detect a special analyte in the analyzed sample. Multiple readings are made on each bead set resulting in an individual fluorescent signal for each assay. This technology allows rapid and accurate analysis of up to 100 unique assays within a single sample.

 

 

Mitarbeiter: 

Prof. Dr. I. Nolte, PD Dr. Murua Escobar, Dr. S. Willenbrock, F. L. Ripoli    

 

Kooperationspartner:  

Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein    

 

Laufzeit:  

seit 2013, fortlaufend

 

Kooperationen außerhalb der TiHo

  • Biomedizinische Optik, Biophotonische Bildgebung und Manipulation, Laser Zentrum Hannover
  • Institut für Biophysik, Zellphysiologie & Zelluläre Mechanik, Leibniz Universität Hannover
  • Institut für Quantenoptik, Leibniz Universität Hannover
  • Institut für Umformtechnik und Umformmaschinen, Leibniz Universität Hannover,
  • Klinik für Orthopädie (im Annastift), Medizinische Hochschule Hannover
  • Zentrum für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde, Medizinische Hochschule Hannover
  • Klinik für Innere Medizin III - Hämatologie, Onkologie, Palliativmedizin, Universität Rostock
  • Clinical Pathology, Department of Pathobiology, Veterinärmedizinische Universität Wien
  • Institut für Spezielle Zoologie und Evolutionsbiologie, FSU-Jena
  • Institut für Werkstoffkunde, Leibniz Universität Hannover
  • Tierärztliches Institut, Abteilung Molekulare Biologie der Nutztiere, Georg-August-Universität Göttingen
  • Zentrum für Humangenetik, Universität Bremen
  • Institut für Pathologie, Medizinische Hochschule Hannover
  • Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde, Medizinische Hochschule Hannover
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